Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door RO1HL135846 en een Children's Development Institute subsidie (PD-II-2016-529).

Het hier beschreven protocol werd goedgekeurd door de Washington University in St. Louis Animal Care and use Committee (IACUC).
1. muisbehuizing en experimenteel ontwerp
<ol><li>Om dagelijkse ritmes in eiwit omzet te detecteren, huis muizen (mannelijk of vrouwelijk C57BL/6J, 4 − 8 week oud, 20 − 25 g) onder standaard 12 h licht/donkere cycli met voedsel verstrekt ad libitum. Om te voorkomen dat de dieren te benadrukken, acclimatiseren muizen gedurende ten minste één week in de...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

Ons protocol beschrijft een technisch eenvoudig middel voor het meten van biologische ritmes in eiwit omzet bij muizen die gebruikmaken van algemeen verkrijgbare moleculaire biologie apparatuur. Vanwege de duur van de tijdreeksen experimenten en het aantal betrokken biologische monsters, is het belangrijk om consistent te zijn over het hele experiment met betrekking tot hoe de muizen worden geïnjecteerd, de timing van weefsel verwerving en de biochemische verwerking van Monsters. De injectie, euthanasie en cervicale dis...

Circadiane ritmes verwijzen naar dagelijkse, voorspelbare variaties in biologische functie die zichtbaar zijn in de hele natuur. Ze bestaan op elke biologische schaal, van macroscopisch gedrag zoals slaap-waak cycli, tot moleculaire fenomenen zoals de ritmische overvloed van biomoleules. In de afgelopen jaren is het onderzoek naar circadiane ritmes getransformeerd door de ontdekking van "klok genen" die van cruciaal belang zijn voor de circadiane ritme generatie. Studies in de klok Gene knock-out muizen hebben een centrale rol voor circadiane ritmes onthuld in het tijdelijk organiseren van kern cellulaire processen zoals metabolisme1. Onder de manieren die circadiane ritmes maken dit gebeurt door het doorvoeren van een temporele structuur aan eiwit katabolisme.
Verschillende groepen, waaronder de onze, hebben aangetoond dat de twee belangrijkste wegen voor cellulaire eiwit katabolisme, autophagie en het ubiquitin-proteasome-systeem, onderhevig zijn aan de diurnale ritmes2,3,4,5. Autophagy vertegenwoordigt de lysosome-afhankelijke arm van eiwit katabolisme waarbij eiwitten van belang worden geleverd aan deze degradatieve organel hetzij door de bouw van een roman blaasje (macroautophagy) of via directe translocatie hoewel een kanaal (Chaperone gemedieerde autophagy)6. Het ubiquitin-proteasome-systeem is het belangrijkste niet-lysosomale traject, waar eiwitten poly-alomtegenwoordig zijn en vervolgens in het proteasoom worden gevoerd, een macromoleculaire degradatieve machine die wordt gevonden in het cytoplasma en Nucleus7,8. Ritmes in autophagic en proteasomale activiteit zijn belangrijk omdat ze waarschijnlijk een rol spelen in de cellulaire huishouding. Als gevolg hiervan is het waardevol om een gestandaardiseerde procedure te hebben die dagelijkse oscillaties in eiwit katabolisme kan detecteren die compatibel is met preklinische ziekte modellen.
Hier bieden we ons protocol voor het kwantificeren van de diurnale variaties in autophagic flux in muis lever, die als basis voor het werk in ons laboratorium3,9heeft gediend. Onze methode is geclassificeerd als een "omzet assay"10, een benadering die door tal van groepen wordt gebruikt om Proteolytische activiteit (of flux) te meten. In deze benadering worden proteaseremmers die specifiek zijn voor lysosomen of Proteasomen toegediend aan muizen en vervolgens worden weefselmonsters verkregen na een vast tijdsinterval. Parallel, weefselmonsters worden verkregen van muizen onderworpen aan schijn injecties. De weefselmonsters worden gehomogeniseerd en vervolgens biochemisch gescheiden om de lysosome-verrijkt en cytoplasmische fracties te verkrijgen. Deze fracties worden vervolgens parallel geanalyseerd via Western blotting met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor macroautophagy markers (LC3b en P62) of proteasomale substraten (poly-alomtegenwoordige eiwitten). Na verloop van tijd verzamelen dieren die met proteaseremmers zijn geïnjecteerd eiwitten die normaalgesproken zijn gerecycled. Dientengevolge wordt het percentage van de omzet afgeleid door de overvloed aan marker proteïnen in de behandelde monsters van de protease-remmer te vergelijken met de met placebo behandelde monsters. Door deze methode op vaste tijdstippen gedurende de dag te herhalen, is het mogelijk om circadiane variaties in proteolyse te reconstrueren (Figuur 1a).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

Cellen maken gebruik van verschillende methoden voor het recyclen van ongewenste eiwitten en ander materiaal, waaronder lysosomale en niet-lysosomale trajecten. Het belangrijkste lysosome-afhankelijke traject wordt autophagie genoemd, terwijl de primaire niet-lysosomale methode voor eiwit katabolisme het ubiquitin-proteasome systeem is. Recente studies in model organismen suggereren dat de activiteit van zowel autophagie als het ubiquitin-proteasome systeem niet constant is gedurende de dag, maar in plaats daarvan varieert volgens een dagelijks (circadiane) ritme. Het vermogen om biologische ritmes in eiwit omzet te meten is belangrijk om te begrijpen hoe cellulaire kwaliteitscontrole wordt bereikt en om de dynamiek van specifieke eiwitten van belang te begrijpen. Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor het kwantificeren van autophagische en proteasomale flux in vivo die de circadiane component van eiwit omzet vangt. Ons protocol bevat Details voor muis afhandeling, weefsel verwerking, fractionering en autophagische flux kwantificering met behulp van de muis lever als uitgangsmateriaal.

Representatieve gegevens worden weergegeven in Figuur 2A, B, en de kwantificering van deze gegevens vindt u in Figuur 2C, D (Zie ook aanvullend bestand "voorbeeldgegevens"). Voor het gemak hebben we geen laad regelaars afgebeeld in Figuur 2 , maar deze moeten parallel worden verkregen. Typisch, westerse blots tegen β-actin worden gebruikt voor dit doel, maar een totale proteïne vl...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux at JoVE.com

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

We beschrijven ons protocol voor het meten van biologische ritmes in eiwit katabolisme via autophagy en het proteasoom in muis lever.

Het meten van de diurnale ritmes in autophagic en Proteasomale flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Ons protocol maakt het mogelijk om de snelheid van autofagie en proteasomale activiteit in muisweefsels te meten en is gevoelig genoeg om circadiane variaties binnen deze activiteiten te detecteren. Deze techniek kan in vivo worden gebruikt om eiwitkatabolisme in cellen en weefsels te evalueren en de benodigde materialen zijn relatief low-tech en toegankelijk voor elk moleculair biologielab. Het aantonen van de procedure zal Mikhail Ryzhikov zijn, een post-doc van mijn laboratorium.Verwarm de leupeptine- en bortezomib-voorraadoplossingen gedurende een kwartier voor elk timepoint om kamertemperatuur te krijgen en verdun de ontdooide bortezomib in steriele PBS om een 50 milligram per milliliter werkoplossing op te leveren. Voor proteaseremmer toediening injecteer intraperitoneally 40 milligram per kilogram leupeptine of 1,6 microgram per kilogram bortezomib in elk proefdier. Voor een negatieve controle, injecteer muizen met 0,5 milliliter PBS.Breng elke muis terug naar kooien gegroepeerd door het type behandeling dat wordt ontvangen terwijl ze worden geïnjecteerd en noteren de tijd dat de muizen worden behandeld of gemanipuleerd in een gestandaardiseerde tabel. Twee uur na de injectie, dompel de linker leverkwab geoogst van elk geofferd proefdier in zeven milliliter van ijskoude homogenisatie buffer in de juiste etikettering 15 milliliter conische buizen op ijs. Wanneer alle monsters zijn verworven, breng het eerste monster en het volledige volume van de homogenisatie buffer in een 15 milliliter capaciteit Dounce homogenisator en homogeniseren het monster met 10 slagen van de losse zuiger en 15 slagen van de strakke zuiger.Breng het resulterende ruwe homogenaat terug naar de oorspronkelijke buis en homogeniseer het volgende monster zoals zojuist is aangetoond. Wanneer alle monsters zijn gehomogeniseerd, sediment de homogenaat kernen en puin door centrifugatie en de overdracht van de top vier milliliter van elke post-nucleaire supernatant in nieuwe 15 milliliter buizen. Bepaal de eiwitconcentratie van deze eerste supernatant fractie volgens standaardprotocollen en egaliseer de concentraties van alle monsters tot 2,1 milligram per milliliter met verse homogenisatiebuffer indien nodig.Voor downstream analyse en kwaliteitsverbetering, aliquot 500 microliters van de genormaliseerde totale eiwitfracties in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor min 80 graden Celsius opslag. Breng 1,5 milliliter van elk van de resterende totale eiwitfracties over in afzonderlijke microcentrifugebuizen en pellet de eiwitmonsters door middel van centrifugatie. Breng één milliliter van de resulterende tweede fractiesupernatants in nieuwe microcentrifugebuizen op ijs over en aspirate de resterende supernatants.Was de 3K pellets twee keer in 1,5 milliliter verse koude homogenisatie buffer per wasbeurt, dan resuspend de 3K pellet in 200 microliters van SDS-PAGE monster buffer en kook de monsters op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Draai de tweede fractie supernatants gedurende 20 minuten op 20, 000 x g en vier graden Celsius en breng de resulterende derde cytoplasmische fractiesupernatants over in een nieuwe microcentrifuge buis. Voor SDS-PAGE analyse, combineren 150 microliter van de cytoplasmische fractie met 50 microliter van 4x SDS-PAGINA monster buffer en kook de cytoplasmische fractie monsters op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten.Aspirate de resterende supernatant uit de 20K pellets en was de monsters twee keer met 1,5 milliliter verse koude homogenisatie buffer per wasbeurt. Dan resuspend de 20K pellet in 100 microliters van SDS-PAGE monster buffer voor koken op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voor westerse vlekanalyse verdunnen standaardcurve-eiwitten in serie één tot drie in 1x monsterbuffer voor een totaal van zes verdunningen en belast vervolgens 10 microliters van elke standaardcurvemonster in één put van een 26-put van vier tot 12% SDS-PAGE midi gel en laadt vervolgens een voorgevlekte commerciële moleculaire gewichtsnorm.Om de autophagische flux te meten, laad je 12 microliters van elk 3K pelletmonster in de juiste putten. Om de proteasomale flux te meten, laadt u 12 microliter van elke cytoplasmische fractie in de juiste putten. Wanneer alle controle- en experimentele monsters zijn geladen, scheidt u de eiwitmonsters van SDS-PAGE voordat u de eiwitten overdraagt aan fluoridemembranen van polyvinyliden volgens standaardprotocollen.Voor het analyseren van macroautophagische flux, dep membranen met de 3K pellet monsters met anti-p62 of anti-LcB antilichaam 's nachts op vier graden Celsius. Voor het analyseren van proteasomale flux, vlekken membranen met de cytoplasmische fractie monsters met anti-lysine 48-Specifieke poly ubiquitine antilichaam 's nachts op vier graden Celsius. Beeld vervolgens de westelijke vlekken met behulp van standaard secundaire antilichamen en beeldvormingsapparaten.Als u densitometrische metingen wilt uitvoeren op interessebanden voor zowel de standaardcurve als experimentele monsters, opent u een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse en tekent u een lange rechthoek die de eiwitmonomeer van belang onder aan het vlekbeeld omvat dat zich uitstrekt tot aan de bovenkant van het membraan. Kopieer en plak om de rechthoek naar de resterende monsters te verplaatsen, zodat de rechthoek consistent blijft tussen de monsters. Sla de kwantificering op in een spreadsheet en genereer een densitometrische standaardcurve binnen de spreadsheet met behulp van het serieel verdunde standaardmonster in lineaire of polynomale regressie om een best-fit standaardcurvevergelijking te verkrijgen.Met behulp van deze vergelijking extrapoleert u de hoeveelheid van de monomeren van belang binnen de experimentele monsters. Om fluxmetingen te verkrijgen, trekt u de geëxtrapoleerde eiwithoeveelheid van elk behandeld monster van de gemiddelde waarde van de PBS-monsters af van hetzelfde tijdpunt. Evalueer vervolgens de statistische significantie van de temporele variatie in de eiwitomzet met behulp van one-way ANOVA.De primaire uitlezing voor autofagische flux op een bepaald momentpunt is het verschil in de hoeveelheid macroautofagie specifieke markers tussen de leupeptine behandeld versus de sham monsters in de lysosoom verrijkte 3K pellet fractie gedeeld door twee. Meestal worden de resultaten genormaliseerd tot het gemiddelde dat de vergelijking tussen onafhankelijke experimenten vereenvoudigt. Onze procedure voor het meten van proteolytische flux hangt af van het vermogen van leupeptine of bortezomib om de accumulatie van autofagie en proteasoom substraten te veroorzaken, wat een tijdsafhankelijk proces is.Deze techniek heeft toegestaan verkenning van hoe biologische ritmes programma levereiwit katabolisme. We hopen dat het de weg zal effenen voor het onderzoeken van de effecten van ziekte op cellulaire huishoudelijke functies.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Het meten van Fast Calcium stromen in cardiomyocyten

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Meten Ruimtelijke en temporele Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in Arabidopsis Planten

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...