Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
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Ces travaux ont été financés par RO1HL135846 et une subvention de l'Institut de développement de l'enfance (PD-II-2016-529).

Le protocole décrit ici a été approuvé par l'Université de Washington à St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Logement de souris et conception expérimentale
<ol><li>Pour détecter les rythmes quotidiens dans le renouvellement des protéines, les souris domestiques (mâles ou femelles C57BL/6J, 4 à 8 semaines, 20 à 25 g) dans le cadre de cycles standard de lumière/obscurité de 12 h avec de la nourriture fournie ad libitum. Pour éviter de stresser les animaux...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

Notre protocole décrit un moyen techniquement simple de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines chez les souris à l'aide d'équipements de biologie moléculaire couramment disponibles. En raison de la durée des expériences de la série chronologique et du nombre d'échantillons biologiques impliqués, il est important d'être cohérent dans l'ensemble de l'expérience en ce qui concerne la façon dont les souris sont injectées, le moment de l'acquisition des tissus et le traitement bioc...

Les rythmes circadiens se réfèrent à des variations quotidiennes et prévisibles de la fonction biologique qui sont apparentes dans toute la nature. Ils existent à toutes les échelles biologiques, des comportements macroscopiques comme les cycles veille-sommeil, aux phénomènes moléculaires comme l'abondance rythmique des biomolécules. Ces dernières années, la recherche sur les rythmes circadiens a été transformée par la découverte de « gènes de l'horloge » qui sont essentiels pour la génération de rythmes circadiens. Les études dans les souris knock-out de gène d'horloge ont indiqué un rôle central pour des rythmes circadiens en organisant temporellement des processus cellulaires de noyau tels que le métabolisme1. Parmi les façons dont les rythmes circadiens y arriver est de transmettre une structure temporelle au catabolisme protéique.
Plusieurs groupes, dont le nôtre, ont montré que les deux principales avenues pour le catabolisme des protéines cellulaires, l'autophagie et le système ubiquitine-protéasome, sont soumises à des rythmes diurnes2,3,4,5. L'autophagie représente le bras lysosome-dépendant du catabolisme protéique dans lequel les protéines d'intérêt sont livrées à cet organelle dégradante soit par la construction d'une vésicule nouvelle (macroautophagie) ou par translocation directe par un canal (autophagie médiée par chaperon)6. Le système ubiquitine-protéasome est la principale voie non-lysosomale, où les protéines sont poly-ubiquitinated et ensuite alimentés dans le protéasome, une machine de dégradation macromoléculaire trouvée dans tout le cytoplasme et le noyau7,8. Les rythmes dans l'activité autophagique et protéasomale sont importants parce qu'ils jouent probablement un rôle dans l'entretien ménager cellulaire. En conséquence, il est utile d'avoir une procédure standardisée qui peut détecter les oscillations quotidiennes dans le catabolisme protéique qui est compatible avec les modèles précliniques de maladie.
Ici, nous fournissons notre protocole pour quantifier les variations diurnes dans le flux autophégique dans le foie de souris, qui a servi de base pour le travail dans notre laboratoire3,9. Notre méthode est classée comme un « ruse »10, une approche utilisée par de nombreux groupes pour mesurer l'activité protéolytique (ou flux). Dans cette approche, des inhibiteurs de la protéase spécifiques aux lysosomes ou aux protéasomes sont administrés à des souris, puis des échantillons de tissus sont obtenus après un intervalle de temps fixe. En parallèle, des échantillons de tissus sont obtenus à partir de souris soumises à des injections fictives. Les échantillons de tissus sont homogénéisés, puis biochimiques séparés pour obtenir les fractions lysosome-enrichies et cytoplasmiques. Ces fractions sont ensuite analysées en parallèle par le biais de ballonnements occidentaux à l'aide d'anticorps spécifiques aux marqueurs macroautophanes (LC3b et p62) ou de substrats protéasomals (protéines poly-ubiquitinated). Au fil du temps, les animaux injectés avec des inhibiteurs de la protéase accumulent des protéines qui auraient normalement été recyclées. En conséquence, le taux de rotation est déduit en comparant l'abondance des protéines marqueurs dans les échantillons traités par protéase-inhibiteur aux échantillons traités par faux. En répétant cette méthode à intervalles fixes tout au long de la journée, il est possible de reconstituer les variations circadiennes de la protéolyse (Figure 1A).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

Les cellules utilisent plusieurs méthodes pour recycler les protéines indésirables et d'autres matériaux, y compris les voies lysosomal et non-lysosomal. La voie lysosome-dépendante principale est appelée autophagie, alors que la méthode non-lysosomale primaire pour le catabolisme de protéine est le système ubiquitine-protéasome. Des études récentes sur des organismes modèles suggèrent que l'activité de l'autophagie et du système ubiquitine-protéasome n'est pas constante tout au long de la journée, mais varie plutôt selon un rythme quotidien (circadien). La capacité de mesurer les rythmes biologiques dans le renouvellement des protéines est importante pour comprendre comment le contrôle de la qualité cellulaire est atteint et pour comprendre la dynamique de protéines spécifiques d'intérêt. Ici nous présentons un protocole normalisé pour quantifier le flux autophagique et protéasomal in vivo qui capture la composante circadienne du chiffre d'affaires de protéine. Notre protocole inclut des détails pour la manipulation de souris, le traitement de tissu, la fractionnement, et la quantification automatique de flux utilisant le foie de souris comme matériel de commencement.

Les données représentatives sont présentées à la figure 2A,B, et la quantification de ces données est fournie à la figure 2C,D (voir aussi Le fichier supplémentaire « Données d'échantillon »). Par souci de simplicité, nous n'avons pas représenté les commandes de chargement à la figure 2, mais celles-ci doivent être obtenues en parallèle. Typiquement, les taches occ...

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Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Nous décrivons notre protocole pour mesurer des rythmes biologiques dans le catabolisme de protéine par l'autophagie et le protéasome dans le foie de souris.

Mesurer les rythmes diurnes dans le flux autophagique et protéasomal

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Notre protocole permet de mesurer le taux d’autophagie et d’activité protéasomale dans les tissus de souris et est suffisamment sensible pour détecter les variations circadiennes au sein de ces activités. Cette technique peut être utilisée in vivo pour évaluer le catabolisme protéique dans les cellules et les tissus et les matériaux requis sont relativement peu technologiques et accessibles à n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire. Mikhaïl Ryzhikov, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pendant quinze minutes avant chaque point de temps, réchauffer les solutions de bouillon de leupeptine et de bortézomib à température ambiante et diluer le bortézomib décongelé dans un PBS stérile pour produire une solution de travail de 50 milligrammes par millilitre. Pour l’administration d’inhibiteurs de la protéase, injectez intrapétoneally 40 milligrammes par kilogramme de leupeptine ou 1,6 microgramme par kilogramme de bortézomib dans chaque animal expérimental. Pour un contrôle négatif, injecter aux souris 0,5 millilitres de PBS.Retournez chaque souris dans des cages regroupées par le type de traitement reçu au fur et à mesure qu’elles sont injectées et enregistrez le temps pendant laquelle les souris sont traitées ou manipulées dans une table normalisée. Deux heures après l’injection, submergez le lobe hépatique gauche récolté de chaque animal expérimental sacrifié dans sept millilitres de tampon d’homogénéisation glacée dans des tubes coniques de 15 millilitres dûment étiquetés sur la glace. Lorsque tous les échantillons ont été acquis, transférer le premier échantillon et l’ensemble du volume du tampon d’homogénéisation dans un homogénéisateur Dounce de 15 millilitres de capacité et homogénéiser l’échantillon avec 10 coups du piston lâche et 15 coups du piston serré.Retournez l’homogénéité brute qui en résulte à son tube d’origine et homogénéisez l’échantillon suivant comme nous venons de le démontrer. Lorsque tous les échantillons ont été homogénéisés, sédimenter les noyaux homogénéisés et les débris par centrifugation et transférer les quatre millilitres les plus hauts de chaque supernatant post-nucléaire dans de nouveaux tubes de 15 millilitres. Déterminer la concentration protéique de cette première fraction supernatante selon les protocoles standard et égaliser les concentrations de tous les échantillons à 2,1 milligrammes par millilitre avec tampon d’homogénéisation fraîche au besoin.Pour l’analyse en aval et l’amélioration de la qualité, aliquot 500 microlitres des fractions de protéines totales normalisées en tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Transférer 1,5 millilitres de chacune des fractions de protéines totales restantes dans des tubes de microcentrifugeuses individuels et granuler les échantillons de protéines par centrifugation. Transférer un millilitre des supernatants de deuxième fraction qui en résultent dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse sur la glace et aspirer les supernatants restants.Lavez les granulés 3K deux fois dans 1,5 millilitres de tampon d’homogénéisation froide fraîche par lavage, puis réutilisez la pastille 3K dans 200 microlitres de tampon d’échantillon SDS-PAGE et faites bouillir les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Faites tourner les supernatants de la deuxième fraction pendant 20 minutes à 20 000 x g et quatre degrés Celsius et transférez les supernatants de la troisième fraction cytoplasmique qui en résultent dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Pour l’analyse SDS-PAGE, combinez 150 microlitres de la fraction cytoplasmique avec 50 microlitres de tampon d’échantillon 4x SDS-PAGE et faites bouillir les échantillons de fraction cytoplasmique à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.Aspirez le supernatant restant des granulés de 20 000 et lavez les échantillons deux fois avec 1,5 millilitres de tampon d’homogénéisation froide fraîche par lavage. Puis résuspendez la pastille de 20 000 dans 100 microlitres de tampon d’échantillon SDS-PAGE pour faire bouillir à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour l’analyse des taches occidentales, diluez périodiquement les protéines courbes standard s’érifiant d’un à trois dans un tampon d’échantillon 1x pour un total de six dilutions et chargez 10 microlitres de chaque échantillon de courbe standard dans un puits d’un gel midi 26 well four to 12%SDS-PAGE, puis chargez une norme de poids moléculaire commercial prétachée.Pour mesurer le flux autophagique, chargez 12 microlitres de chaque échantillon de granulés de 3K dans les puits appropriés. Pour mesurer le flux protéasomal, chargez 12 microlitres de chaque fraction cytoplasmique dans les puits appropriés. Lorsque tous les échantillons de contrôle et expérimentaux ont été chargés, séparez les échantillons de protéines par SDS-PAGE avant de transférer les protéines aux membranes de fluorure polyvinylidene selon les protocoles standard.Pour analyser le flux macroautophagique, les membranes de tache contenant les échantillons de granulés 3K avec anti-p62 ou anticorps anti-LcB pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Pour analyser le flux protéasomal, les membranes de tache contenant les échantillons de fraction cytoplasmique avec l’anti-lysine 48-Spécifique anticorps de poly ubiquitine pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Imagez ensuite les taches occidentales à l’aide d’anticorps secondaires standard et de dispositifs d’imagerie.Pour effectuer des mesures densitométriques sur les bandes d’intérêt pour la courbe standard et les échantillons expérimentaux, ouvrez un logiciel d’analyse d’image approprié et dessinez un long rectangle englobant le monomère protéique d’intérêt au bas de l’image de tache s’étendant jusqu’au sommet de la membrane. Copier et coller pour déplacer le rectangle vers les échantillons restants, en gardant le rectangle cohérent entre les échantillons. Enregistrez la quantification sur une feuille de calcul et générez une courbe standard densitométrique dans la feuille de calcul à l’aide de l’échantillon standard dilué en série dans une régression linéaire ou polynomiale afin d’obtenir une équation de courbe standard la mieux adaptée.À l’aide de cette équation, extrapoler la quantité de monomères d’intérêt dans les échantillons expérimentaux. Pour obtenir des mesures de flux, soustrayez la quantité de protéines extrapolée de chaque échantillon traité par inhibiteur de la valeur moyenne des échantillons de PBS à partir du même point de temps. Évaluez ensuite la signification statistique de la variation temporelle du chiffre d’affaires des protéines à l’aide d’ANOVA uni-sens.La lecture primaire pour le flux autophagique à n’importe quel point de temps donné est la différence dans la quantité de marqueurs spécifiques de macroautophagy entre la leupeptine traitée contre les échantillons factices dans la fraction 3K lysosome-enrichie de granule divisée par deux. En règle générale, les résultats sont normalisés à la moyenne qui simplifie la comparaison entre les expériences indépendantes. Notre procédure de mesure du flux protéolytique dépend de la capacité de la leupeptine ou du bortézomib à provoquer l’accumulation de substrats autophagie et protéasome, qui est un processus dépendant du temps.Cette technique a permis d’explorer comment les rythmes biologiques programment le catabolisme des protéines hépatiques. Nous espérons qu’il ouvrira la voie à l’étude des effets de la maladie sur les fonctions d’entretien ménager cellulaire.

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