Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch RO1HL135846 und ein Stipendium des Children es Development Institute (PD-II-2016-529) finanziert.

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Washington University in St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Mausgehäuse und experimentelles Design
<ol><li>Um tägliche Rhythmen im Proteinumsatz zu erkennen, hause Mäuse (männlich oder weiblich C57BL/6J, 4 x 8 Wochen alt, 20-25 g) unter Standard 12 h Licht/Dunkel-Zyklen mit Lebensmitteln ad libitumzur Verfügung gestellt. Um Stress zu vermeiden, können Sie Mäuse mindestens eine Woche lang in der Anlage vo...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

Unser Protokoll beschreibt ein technisch unkompliziertes Mittel zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinumsatz von Mäusen mit allgemein verfügbaren molekularbiologischen Geräten. Aufgrund der Länge der Zeitreihenexperimente und der Anzahl der beteiligten biologischen Proben ist es wichtig, während des gesamten Experiments konsistent zu sein, wie die Mäuse injiziert werden, den Zeitpunkt der Gewebeaufnahme und die biochemische Verarbeitung von Proben. Die Injektions-, Euthanasie- und Zervixdislokationsschritte k...

Zirkadische Rhythmen beziehen sich auf tägliche, vorhersehbare Variationen der biologischen Funktion, die in der ganzen Natur sichtbar sind. Sie existieren auf jeder biologischen Skala, von makroskopischen Verhaltensweisen wie Schlaf-Wach-Zyklen bis hin zu molekularen Phänomenen wie der rhythmischen Fülle von Biomolekülen. In den letzten Jahren hat sich die Erforschung zirkadianer Rhythmen durch die Entdeckung von "Uhrengenen" verändert, die für die zirkadiane Rhythmuserzeugung entscheidend sind. Studien an Clock-Gen-Knockout-Mäusen haben eine zentrale Rolle für zirkadiane Rhythmen bei der zeitlichen Organisation von kernzellulären Prozessen wie Stoffwechsel1gezeigt. Zu den Möglichkeiten, wie zirkadiane Rhythmen dies ermöglichen, gehört die Vermittlung einer zeitlichen Struktur zum Proteinkatabolismus.
Mehrere Gruppen, darunter unsere, haben gezeigt, dass die beiden Hauptwege für zellulären Proteinkatabolismus, Autophagie und das Ubiquitin-Proteasom-System, den Tagesrhythmen2,3,4,5unterliegen. Die Autophagie stellt den lysosomenabhängigen Arm des Proteinkatabolismus dar, in dem Proteine von Interesse entweder durch den Bau einer neuartigen Vesikel (Makroautophagie) oder durch direkte Translokation durch eine Kanal (Chaperon vermittelte Autophagie)6. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist der wichtigste nicht-lysosomale Weg, bei dem Proteine polyubiquitiniert und dann in das Proteasom eingespeist werden, eine makromolekulare Degradative Maschine, die im gesamten Zytoplasma und Kern gefunden wird7,8. Rhythmen in autophagischer und proteasomaler Aktivität sind wichtig, weil sie wahrscheinlich eine Rolle in der zellulären Haushaltsführung spielen. Daher ist es wertvoll, ein standardisiertes Verfahren zu haben, das tägliche Schwingungen im Proteinkatabolismus erkennen kann, die mit präklinischen Krankheitsmodellen kompatibel sind.
Hier stellen wir unser Protokoll zur Quantifizierung von Tagesschwankungen im autophagischen Fluss in der Mausleber zur Verfügung, das als Grundlage für die Arbeit in unserem Labordiente 3,9. Unsere Methode wird als "Umsatz-Assay"10klassifiziert, ein Ansatz, der von zahlreichen Gruppen verwendet wird, um proteolytische Aktivität (oder Fluss) zu messen. Bei diesem Ansatz werden Proteasehemmer, die für Lysosomen oder Proteasomen spezifisch sind, Mäusen verabreicht und anschließend Gewebeproben nach einem festen Zeitintervall erhalten. Parallel dazu werden Gewebeproben von Mäusen gewonnen, die Scheininjektionen unterzogen werden. Die Gewebeproben werden homogenisiert und dann biochemisch getrennt, um die lysosososomeangereicherten und zytoplasmatischen Fraktionen zu erhalten. Diese Fraktionen werden dann parallel über Western Blotting mit Antikörpern analysiert, die spezifisch für makroautophagy Marker (LC3b und p62) oder proteasomale Substrate (poly-ubiquitiniertes Protein) sind. Im Laufe der Zeit akkumulieren Tiere, die mit Proteasehemmern injiziert werden, Proteine, die normalerweise recycelt worden wären. Infolgedessen wird die Umsatzrate durch den Vergleich der Häufigkeit von Markerproteinen in den mit Protease-Hemmerbehandelten behandelten Proben mit den scheinbehandelten Proben abgeleitet. Durch die Wiederholung dieser Methode in festen Zeitintervallen über den Tag ist es möglich, zirkadiane Variationen in der Proteolyse zu rekonstruieren (Abbildung 1A).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

Zellen verwenden mehrere Methoden zum Recycling unerwünschter Proteine und anderer Materialien, einschließlich lysosomaler und nicht-lysosomaler Wege. Der Hauptlysosome-abhängige Weg wird Autophagie genannt, während die primäre nicht-lysosomale Methode für Proteinkatabolismus das Ubiquitin-Proteam-System ist. Jüngste Studien an Modellorganismen deuten darauf hin, dass die Aktivität sowohl der Autophagie als auch des Ubiquitin-Proteasom-Systems nicht täglich konstant ist, sondern je nach täglichem (zirkadianem) Rhythmus variiert. Die Fähigkeit, biologische Rhythmen im Proteinumsatz zu messen, ist wichtig, um zu verstehen, wie die zelluläre Qualitätskontrolle erreicht wird, und um die Dynamik bestimmter Proteine von Interesse zu verstehen. Hier präsentieren wir ein standardisiertes Protokoll zur Quantifizierung des autophagischen und proteasomalen Flusses in vivo, das die zirkadiane Komponente des Proteinumsatzes erfasst. Unser Protokoll enthält Details zur Maushandhabung, Gewebeverarbeitung, Fraktionierung und autophagischen Flussquantifizierung mit Mausleber als Ausgangsmaterial.

Repräsentative Daten sind in Abbildung 2A,Bdargestellt, und die Quantifizierung dieser Daten ist in Abbildung 2C,D enthalten (siehe auch Zusatzdatei "Beispieldaten"). Der Einfachheit halber haben wir die Ladesteuerungen in Abbildung 2 nicht dargestellt, aber diese sollten parallel erhalten werden. Typischerweise werden zu diesem Zweck westliche Flecken gegen das -Actin verwendet, a...

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Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Wir beschreiben unser Protokoll zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinkatabolismus über Autophagie und das Proteasom in der Mausleber.

Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Unser Protokoll ermöglicht die Messung der Rate der Autophagie und proteasomale Aktivität in Mausgeweben und ist empfindlich genug, um zirkadiane Variationen innerhalb dieser Aktivitäten zu erkennen. Diese Technik kann in vivo verwendet werden, um Proteinkatabolismus in Zellen und Geweben zu bewerten und die erforderlichen Materialien sind relativ technologiearm und für jedes molekularbiologische Labor zugänglich. Demonstrieren das Verfahren wird Michail Ryzhikov, ein Post-Doc aus meinem Labor sein.15 Minuten vor jedem Zeitpunkt die Leupeptin- und Bortezomib-Lagerlösungen auf Raumtemperatur erwärmen und das aufgetaute Bortezomib in sterilem PBS verdünnen, um eine Arbeitslösung von 50 Milligramm pro Milliliter zu ergeben. Zur Verabreichung von Proteasehemmern injiziert intraperitoneal 40 Milligramm pro Kilogramm Leupeptin oder 1,6 Mikrogramm pro Kilogramm Bortezomib in jedes Versuchstier. Für eine Negative Kontrolle, injizieren Sie Mäuse mit 0,5 Milliliter PBS.Bringen Sie jede Maus in Käfige zurück, die nach der Art der erhaltenen Behandlung gruppiert sind, während sie injiziert werden, und erfassen Sie die Zeit, in der die Mäuse behandelt oder in einer standardisierten Tabelle bearbeitet werden. Zwei Stunden nach der Injektion den linken Leberlappen, der von jedem geopferten Versuchstier geerntet wurde, in sieben Milliliter eiskalten Homogenisierungspuffer in entsprechend beschrifteten 15 Milliliter konischen Röhren auf Eis untertauchen. Wenn alle Proben erworben sind, übertragen Sie die erste Probe und das gesamte Volumen des Homogenisierungspuffers in einen 15 Milliliter-Kapazität Dounce Homogenisator und homogenisieren Sie die Probe mit 10 Schlägen des losen Kolbens und 15 Schlägen des engen Kolbens.Bringen Sie das resultierende Rohhomogenat in sein ursprüngliches Rohr zurück und homogenisieren Sie die nächste Probe, wie gerade gezeigt. Wenn alle Proben homogenisiert sind, sedimentieren Sie die homogenaten Kerne und Trümmer durch Zentrifugation und übertragen Sie die oberen vier Milliliter jedes postnuklearen Überstandes in neue 15 Milliliter-Rohre. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration dieser ersten Überstandfraktion nach Standardprotokollen und gleichen Die Konzentrationen aller Proben auf 2,1 Milligramm pro Milliliter mit frischem Homogenisierungspuffer bei Bedarf aus.Zur nachgelagerten Analyse und Qualitätsverbesserung werden 500 Mikroliter der normalisierten Gesamtproteinfraktionen in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren für eine Speicherung von minus 80 Grad Celsius umgewandelt. Übertragen Sie 1,5 Milliliter der verbleibenden Gesamtensproteinfraktionen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und pellet die Proteinproben durch Zentrifugation. Übertragen Sie einen Milliliter der resultierenden Überreste der zweiten Fraktion in neue Mikrozentrifugenröhren auf Eis und aspirieren Sie die restlichen Überreste.Waschen Sie die 3K-Pellets zweimal in 1,5 Milliliter frischer Kalthomogenisierungspuffer pro Wäsche, dann setzen Sie das 3K-Pellet in 200 Mikroliter SDS-PAGE-Probenpuffer wieder auf und kochen Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Drehen Sie die Überwälstmittel der zweiten Fraktion 20 Minuten lang bei 20.000 x g und vier Grad Celsius und übertragen Sie die resultierenden dritten zytoplasmatischen Überrupungsmittel in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Kombinieren Sie für die SDS-PAGE-Analyse 150 Mikroliter der zytoplasmatischen Fraktion mit 50 Mikrolitern 4x SDS-PAGE-Probenpuffer und kochen Sie die zytoplasmatischen Fraktionsproben bei 95 Grad Celsius fünf Minuten lang.Den restlichen Überstand aus den 20K Pellets ansaugen und die Proben zweimal mit 1,5 Milliliter frischer Kalthomogenisierungspuffer pro Wäsche waschen. Dann setzen Sie das 20K Pellet in 100 Mikroliter SDS-PAGE Probenpuffer für das Kochen bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten wieder aus. Für die Western Blot-Analyse, seriell verdünnt Standard-Kurvenproteine ein s bis drei in 1x Probenpuffer für insgesamt sechs Verdünnungen und laden 10 Mikroliter jeder Standard-Kurvenprobe in einen Brunnen von 26 gut vier bis 12%SDS-PAGE Midi-Gel, dann laden Sie einen vorgefärbten kommerziellen Molekulargewichtsstandard.Um den autophagischen Fluss zu messen, laden Sie 12 Mikroliter jeder 3K-Pelletprobe in die entsprechenden Brunnen. Um den proteasomalen Fluss zu messen, laden Sie 12 Mikroliter jeder zytoplasmatischen Fraktion in die entsprechenden Brunnen. Wenn alle Kontroll- und Versuchsproben geladen sind, trennen Sie die Proteinproben durch SDS-PAGE, bevor Sie die Proteine gemäß den Standardprotokollen auf Polyvinylidenfluoridmembranen übertragen.Zur Analyse des makroautophagischen Flusses blotmembranen Membranen, die die 3K-Pelletproben mit Anti-p62- oder Anti-LcB-Antikörpern enthalten, über Nacht bei vier Grad Celsius. Zur Analyse des proteasomalen Flusses bloten Membranen, die die zytoplasmatischen Fraktionsproben mit Antilysin 48-Spezifischem Polyubiquitin-Antikörper enthalten, über Nacht bei vier Grad Celsius. Dann stellen Sie die westlichen Flecken mit Standard-Sekundärantikörpern und Bildgebungsgeräten ab.Um densitometrische Messungen an Interessenbändern sowohl für die Standardkurve als auch für experimentelle Proben durchzuführen, öffnen Sie ein geeignetes Bildanalyse-Softwareprogramm und zeichnen Sie ein langes Rechteck, das das Proteinmonomer von Interesse am unteren Rand des Fleckbildes umfasst, das sich bis an die Oberseite der Membran erstreckt. Kopieren und einfügen, um das Rechteck in die verbleibenden Samples zu verschieben, wobei das Rechteck zwischen den Stichproben konsistent bleibt. Speichern Sie die Quantifizierung in einer Kalkulationstabelle, und generieren Sie eine densitometrische Standardkurve innerhalb der Kalkulationstabelle mithilfe der seriell verdünnten Standardstichprobe in linearer oder polynomiader Regression, um eine am besten passende Standardkurvengleichung zu erhalten.Mit dieser Gleichung extrapolieren Sie die Menge der Monomere, die innerhalb der Versuchsproben von Interesse sind. Um Flussmessungen zu erhalten, subtrahieren Sie die extrapolierte Proteinmenge jeder behandelten Inhibitorprobe vom Durchschnittswert der PBS-Proben vom gleichen Zeitpunkt. Bewerten Sie dann die statistische Signifikanz der zeitlichen Variation des Proteinumsatzes mit Hilfe von one-way ANOVA.Die primäre Auslesung für autophagischen Fluss zu einem bestimmten Zeitpunkt ist der Unterschied in der Menge der makroautophagie spezifischen Marker zwischen dem leupeptin behandelt im Vergleich zu den Scheinproben in der Lysosome-angereicherten 3K-Pelletfraktion geteilt durch zwei. In der Regel werden die Ergebnisse auf den Mittelwert normalisiert, der den Vergleich über unabhängige Experimente hinweg vereinfacht. Unser Verfahren zur Messung des proteolytischen Flusses hängt von der Fähigkeit von Leupeptin oder Bortezomib ab, die Ansammlung von Autophagie- und Proteasomensubstraten zu verursachen, was ein zeitabhängiger Prozess ist.Diese Technik hat die Erforschung ermöglicht, wie biologische Rhythmen Leberprotein-Katabolismus programmieren. Wir hoffen, dass es den Weg für die Untersuchung der Auswirkungen von Krankheiten auf zelluläre Haushaltsfunktionen ebnen wird.

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