Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי RO1HL135846 ומענק מכון לפיתוח ילדים (PD-II-2016-529).

הפרוטוקול המתואר כאן אושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בכנסיית סנט לואיס בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC).
1. מגורי העכבר ותכנון ניסיוני
<ol><li>כדי לזהות מקצבים יומיים במחזור החלבונים, עכברים בבית (זכר או נקבה C57BL/6J, 4-8 שבוע בן, 20 עד 25 גרם) תחת סטנדרטי 12 h מחזורי אור/כהה עם מזון סיפק <em...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

הפרוטוקול שלנו מתאר אמצעי מבחינה טכנית פשוטה למדידת מקצבים ביולוגיים במחזור החלבונים בעכברים באמצעות ציוד מולקולרי זמין נפוץ בביולוגיה. בגלל המשך הניסויים בסדרת הזמן ומספר הדגימות הביולוגי המעורבות, חשוב להיות עקבי לאורך כל הניסוי בנוגע לאופן הזרקת העכברים, התזמון של רכישת רקמות והעיב?...

מקצבים circadian מתייחסים היום, וריאציות צפויות בתפקוד הביולוגי הגלויים ברחבי הטבע. הם קיימים בכל קנה מידה ביולוגי, מהתנהגויות מאקרוסקופיות כמו מחזורי התעוררות לשינה, לתופעות מולקולריות כמו השפע הקצבי של biomolecules. בשנים האחרונות, המחקר לתוך מקצבים מעגליות השתנה על ידי גילוי של "גנים שעון" כי הם קריטיים ליצירת קצב מעגלי. מחקרים בשעון גנים הסתרה עכברים חשפו תפקיד מרכזי עבור מקצבים מעגליות באופן זמני ארגון תהליכים סלולאריים ליבה כגון חילוף החומרים1. בין הדרכים מקצבים מעגליות לגרום לזה לקרות הוא על ידי הקניית מבנה זמני לקטוליזם חלבון.
מספר קבוצות כולל שלנו הראו כי שתי השדרות הגדולות לקטאבליזם חלבונים סלולריים, התצוגה האוטומטית של מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין, הם כפופים מקצבים יומי2,3,4,5. הבחירה האוטומטית מייצגת את הזרוע התלוית-ליקיה של קטאבוליזם חלבונים, שבה חלבונים מעניינים מועברים לdegradative זה או דרך הבנייה של שלפוחית הרומן (מאקרואוטומטית) או באמצעות טרנסלוקציה ישירה למרות ש ערוץ (שלווה אוטומטית מתווכת)6. מערכת אוביקוויב-פרוטסאין היא מסלול הראשי ללא-ליזוזומלית, שם חלבונים הם פולי-אוביקוויל ולאחר מכן ניזונים לתוך פרוטאסדום, מכונת macromolecular degradative שנמצאו ברחבי הציטופלסמה וגרעין7,8. המקצבים בפעילות האוטומטית והפרוטאספראל הם חשובים מכיוון שהם נוטים לשחק תפקיד במשק הבית הסלולרי. כתוצאה מכך, זה חשוב שיש הליך מתוקננת שיכול לזהות תנודות יומיות של קטאבוליזם חלבונים התואמים עם מודלים טרום קליניים מחלות.
כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו כדי לכמת וריאציות יומי השטף האוטומטי בכבד העכבר, אשר שימש כבסיס לעבודה במעבדה שלנו3,9. השיטה שלנו מסווגת "שיטת מחזור"10, גישה המשמשת על ידי קבוצות רבות כדי למדוד פעילות פרוטחרדה (או שטף). בגישה זו, מעכבי פרוטאז ספציפיים לlysosomes או פרוטאסמס ניתנת לעכברים ולאחר מכן דגימות רקמות מתקבלים לאחר מרווח זמן קבוע. במקביל, דגימות רקמות מתקבלות מעכברים נתון זריקות מזויף. דגימות רקמות הם הומוגניים ולאחר מכן ביולוגי הופרדו כדי לקבל את השברים lysosome מועשר, cytoplasmic. שברים אלה מנותח לאחר מכן במקביל דרך הכתמים המערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים סמנים macroLC3b hagy (ו-p62) או מצעים פרוטאספאל (חלבון פולי-אוביקטים). במשך הזמן, חיות מוזרק עם מעכבי פרוטאז לצבור חלבונים שהיו בדרך כלל היה ממוחזר. כתוצאה מכך, שיעור המחזור משתמעת על ידי השוואת השפע של חלבונים סמן בדגימות פרוטאז-מעכב הטיפול לדגימות מטופל המזויף. על-ידי חזרה על שיטה זו במרווחי זמן קבועים לאורך היום, ניתן לשחזר וריאציות מעגליות ב-פרוטפוליזיס (איור 1A).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

תאים מעסיקים מספר שיטות למיחזור חלבונים בלתי רצויים וחומרים אחרים, כולל ליזוזומיום ושבילים לא-ליסוזומ. המסלול העיקרי התלוי למטה מכונה באופן אוטומטי, ואילו השיטה העיקרית שאינה ליסוזומלית עבור קטאבוליזם חלבונים היא מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין. מחקרים שנעשו לאחרונה במודל אורגניזמים מצביעים על כך שהפעילות של שני הדגמים האוטומטיים ומערכת אוביקוויב-פרוטאסאין אינה קבועה לאורך היום, אך במקום זאת משתנה בהתאם לקצב היומי (circadian). היכולת למדוד מקצבים ביולוגיים במחזור החלבונים חשוב להבין כיצד מושגת בקרת איכות סלולרית ולהבנת הדינמיקה של חלבונים ספציפיים המעניינים אותך. כאן אנו מציגים פרוטוקול מתוקננת עבור ככמת השטף האוטומטי ו הפרוטאסאואל בvivo כי לוכדת את רכיב האחראי של מחזור החלבון. הפרוטוקול שלנו כולל פרטים על הטיפול בעכבר, רקמת עיבוד, משבר, וכימות השטף האוטומטית באמצעות הכבד של העכבר כמו החומר ההתחלתי.

נתונים מייצגים מוצגים באיור 2א, ב, והקוונפיקציה של נתונים אלה מסופקים באיור 2C, D (ראה גם קובץ משלים "מדגם נתונים"). למען הפשטות, לא מתוארת הטענת שולטת באיור 2 אך יש להשיג זאת במקביל. בדרך כלל, בלוטים מערביים נגד β-actin מש...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux at JoVE.com

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו למדידת מקצבים ביולוגיים בקטוליזם חלבונים באמצעות הוראות משוב ושוב בכבד העכבר.

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר מדידה של קצב פעילות אוטופגיה ופרוטאסומאלית ברקמות העכבר והוא רגיש מספיק כדי לזהות וריאציות סביבה בתוך פעילויות אלה. טכניקה זו יכולה לשמש vivo כדי להעריך קטבוליזם חלבון בתאים ורקמות ואת החומרים הנדרשים הם נמוכים יחסית טק ונגיש לכל מעבדה ביולוגיה מולקולרית. מדגים את ההליך יהיה מיכאיל Ryzhikov, פוסט דוקטורט מהמעבדה שלי.במשך רבע שעה לפני כל נקודת זמן, לחמם את פתרונות מלאי leupeptin ו bortezomib לטמפרטורת החדר לדלל את bortezomib מופשר PBS סטרילי להניב פתרון עבודה 50 מיליגרם למיליליטר. עבור ניהול מעכבי פרוטאז, להזריק תוך-אפית 40 מיליגרם לקילוגרם של leupeptin או 1.6 מיקרוגרם לקילוגרם של bortezomib לתוך כל חיה ניסיונית. עבור שליטה שלילית, להזריק עכברים עם 0.5 מיליליטר של PBS.להחזיר כל עכבר לכלובים מקובצים לפי סוג הטיפול המתקבל כפי שהם מוזרקים ולתזמן את הזמן כי העכברים מטופלים או מניפולציה בטבלה מתוקנת. שעתיים לאחר ההזרקה, להטביע את האונה הכבד השמאלי שנקטפו מכל חיה ניסיונית מוקרבת בשבעה מיליליטר של חיץ הומוגניזציה קר קרח כראוי שכותרתו 15 צינורות חרוט מיליליטר על קרח. כאשר כל הדגימות נרכשו, להעביר את המדגם הראשון ואת כל נפח של חיץ הומוגניזציה לתוך קיבולת 15 מיליליטר Dounce homogenizer הומוגניזציה המדגם עם 10 משיכות של בוכנה רופפת 15 משיכות של הבוכנה הדוק.להחזיר את הומוגנט גולמי וכתוצאה מכך לצינור המקורי שלה הומוגניזציה המדגם הבא כפי שהודגם רק. כאשר כל הדגימות כבר homogenized, משכן את הגרעינים הומוגנית ופסולת על ידי צנטריפוגה ולהעביר את ארבעת המיליליטרים העליונים של כל על טבעי פוסט גרעיני לתוך צינורות חדשים 15 מיליליטר. לקבוע את ריכוז החלבון של שבר טבעי ראשון זה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ולהשוות את הריכוזים של כל הדגימות ל 2.1 מיליגרם למיליליטר עם מאגר הומוגניזציה טרי לפי הצורך.לניתוח במורד הזרם ושיפור האיכות, aliquot 500 microliters של שברי החלבון הכולל מנורמל לתוך 1.5 צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר עבור אחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. מעבירים 1.5 מיליליטר מכל אחד משברי החלבון הנותרים לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים ומעבירים את דגימות החלבון על ידי צנטריפוגה. מעבירים מיליליטר אחד של השבר השני של העל-טבעיים לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים על הקרח ושואפים את שאר העל-טבעיים.לשטוף את כדורי 3K פעמיים ב 1.5 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה קר טרי לכל לשטוף, ולאחר מכן resuspend גלולה 3K ב 200 microliters של מאגר מדגם SDS-PAGE ולהרתיח את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לסובב את השבר השני supernatants במשך 20 דקות ב 20, 000 x g וארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את השבר הציטופלזמי השלישי וכתוצאה מכך supernatants לתוך צינור microcentrifuge חדש. לניתוח SDS-PAGE, שלבו 150 מיקרוליטרים של השבר הציטופלסמי עם 50 מיקרוליטרים של מאגר מדגם SDS-PAGE 4x והרתיחו את דגימות השבר הציטופלסמי ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.שאפו את העל-טבעי הנותר מכדורי ה-20K ושטפו את הדגימות פעמיים עם 1.5 מיליליטר של חיץ הומוגניזציה קר טרי לכל שטיפה. לאחר מכן בצעו שימוש חוזר בכדור 20K ב-100 מיקרוליטרים של מאגר מדגם SDS-PAGE לרתיחה ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לניתוח כתם מערבי, לדלל באופן סדרתי חלבונים עקומה סטנדרטית אחד עד שלושה במאגר מדגם 1x עבור סך של שישה דילולים לטעון 10 microliters של כל דגימת עקומה סטנדרטית לתוך באר אחת של 26 גם ארבעה עד 12% SDS-PAGE midi ג'ל, ולאחר מכן לטעון תקן משקל מולקולרי מסחרי prestained.כדי למדוד את שטף autophagic, לטעון 12 microliters של כל דגימת גלולה 3K לתוך בארות המתאימות. כדי למדוד את שטף proteasomal, לטעון 12 microliters של כל שבר ציטופלסמי לתוך בארות המתאימות. כאשר כל הבקרה ודגימות הניסוי נטענו, להפריד את דגימות החלבון על ידי SDS-PAGE לפני העברת החלבונים קרום פלואוריד פוליווינילידין על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.לניתוח שטף מקרואוטופי, ממברנות כתם המכילות את דגימות גלולת 3K עם נוגדן אנטי p62 או אנטי LcB לילה בארבע מעלות צלזיוס. לניתוח שטף פרוטאסומאלי, קרום כתם המכיל את דגימות שבר ציטופלסמי עם נוגדן אנטי ליזן 48 ספציפי פולי ubiquitin לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן תדמיין את הכתמים המערביים באמצעות נוגדנים משניים סטנדרטיים והתקני הדמיה.כדי לבצע מדידות צפיפות על רצועות מעניינות הן עבור העקומה הסטנדרטית והן עבור דגימות ניסיוניות, פתח תוכנה מתאימה לניתוח תמונה וצייר מלבן ארוך המקיף את מונומר החלבון המעניין בתחתית התמונה הכתום המשתרעת לראש הממברנה. העתק והדבק כדי להעביר את המלבן לדגימות הנותרות, תוך שמירה על עקביות המלבן בין הדוגמאות. שמור את הכימות בגיליון אלקטרוני וליצור עקומה סטנדרטית densitometric בתוך הגיליון האלקטרוני באמצעות מדגם סטנדרטי מדולל סדרתי רגרסיה ליניארית או פולינומית כדי להשיג משוואת עקומה סטנדרטית בכושר הטוב ביותר.באמצעות משוואה זו, לשער את כמות המונומרים של עניין בתוך הדגימות הניסיוניות. כדי להשיג מדידות שטף, הפחת את כמות החלבון המוערך של כל מעכב שטופל מדגם מהערך הממוצע של דגימות PBS מאותה נקודת זמן. לאחר מכן להעריך את המובהקת הסטטיסטית של וריאציה זמנית במחזור החלבון באמצעות ANOVA חד-כיוון.הקריאה העיקרית של שטף אוטופגי בכל נקודת זמן נתונה היא ההבדל בכמות סמנים ספציפיים מקרואוטופיים בין leupeptin שטופלו לעומת דגימות מזויפות בשבר גלולה 3K מועשר lysosome מחולק לשניים. בדרך כלל, התוצאות מנורמלות ל הממוצע אשר מפשט את ההשוואה על פני ניסויים עצמאיים. ההליך שלנו למדידת שטף פרוטאוליטי תלוי ביכולת של leupeptin או bortezomib לגרום הצטברות של מצעים autophagy ו proteasome, שהוא תהליך תלוי זמן.טכניקה זו אפשרה לחקור כיצד מקצבים ביולוגיים לתכנת קטבוליזם חלבון בכבד. אנו מקווים שזה יסלול את הדרך לחקירת השפעות המחלה על תפקודי משק הבית התאיים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...