Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
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इस काम RO1HL135846 और एक बाल विकास संस्थान अनुदान (पीडी-II-2016-529) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सेंट लुइस पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) में वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था.
1. माउस आवास और प्रायोगिक डिजाइन
<ol><li>प्रोटीन कारोबार में दैनिक लय का पता...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

हमारे प्रोटोकॉल आमतौर पर उपलब्ध आणविक जीव विज्ञान उपकरण का उपयोग कर चूहों में प्रोटीन कारोबार में जैविक लय को मापने के एक तकनीकी रूप से सरल साधन का वर्णन करता है. समय श्रृंखला प्रयोगों की लंबाई और शामि?...

Circadian लय जैविक समारोह है कि प्रकृति भर में स्पष्ट कर रहे हैं में दैनिक, उम्मीद के मुताबिक बदलाव को देखें. वे हर जैविक पैमाने पर मौजूद हैं, नींद जाग चक्र की तरह स्थूल व्यवहार से, जैव अणुओं की लयबद्ध बहुतायत की तरह आणविक घटना के लिए. हाल के वर्षों में, Circadian लय में अनुसंधान circadian ताल पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं कि "घड़ी जीन" की खोज से बदल दिया गया है. घड़ी जीन नॉकआउट चूहों में अध्ययन इस तरह के चयापचय 1 के रूप में कोर सेलुलर प्रक्रियाओं के आयोजन में circadian लय के लिए एक केंद्रीय भूमिका से पता चलाहै. जिस तरह से circadian लय यह हो बनाने के बीच प्रोटीन catabolism के लिए एक अस्थायी संरचना प्रदान करके है.
हमारे सहित कई समूहों ने दिखाया है कि सेलुलर प्रोटीन कैटाबोलिज्म, ऑटोफैगी और सर्वव्यापक प्रणाली के लिए दो प्रमुख रास्ते, दैनिक लय2,3,4,5के अधीन हैं। स्वभोजी प्रोटीन कैटाबोलिज्म के लाइसोम-निर्भर हाथ का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें ब्याज के प्रोटीन या तो एक उपन्यास आशय (मैक्रोऑटोफैगी) के निर्माण के माध्यम से या प्रत्यक्ष स्थानांतरण के माध्यम से इस अपमानजनक अंग को वितरित किए जाते हैं। चैनल (चैपरोन मध्यस्थता autophagy)6| सर्वव्यापक प्रणाली मुख्य गैर-लाइसोमल मार्ग है, जहां प्रोटीन बहु-सबबीकृत होते हैं और फिर प्रोटीसोम में खिलाया जाता है, एक मैक्रोआण्विक निम्नीकरण मशीन जो कोशिकाद्रव्य और नाभिक में पाई जाती है7,8. ऑटोफैगिक और प्रोटीसोमल गतिविधि में ताल महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे संभवतः सेलुलर गृह व्यवस्था में एक भूमिका निभाते हैं। एक परिणाम के रूप में, यह एक मानकीकृत प्रक्रिया है कि प्रोटीन catabolism है कि पूर्व नैदानिक रोग मॉडल के साथ संगत है में दैनिक दोलनों का पता लगा सकते हैं मूल्यवान है.
यहाँ, हम माउस यकृत में ऑटोफैगिक फ्लक्स में दैनिक विभिन्नता की मात्रा निर्धारित करने के लिए अपना प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो हमारी प्रयोगशाला3,9में कार्य के आधार के रूप में कार्य करता है। हमारी विधि एक "टर्नओवर परख"10के रूप में वर्गीकृत किया गया है, एक प्रोटीओलिटिक गतिविधि (या प्रवाह) को मापने के लिए कई समूहों द्वारा इस्तेमाल किया दृष्टिकोण. इस दृष्टिकोण में, लाइसोसोम या प्रोटेसोम के लिए विशिष्ट प्रोटीज़ अवरोधक चूहों को प्रशासित किए जाते हैं और फिर ऊतक के नमूने एक निश्चित समय अंतराल के बाद प्राप्त किए जाते हैं। समानांतर में, ऊतक के नमूने चूहों से प्राप्त कर रहे हैं शर्म इंजेक्शन के अधीन. ऊतक के नमूने homogenized और फिर जैव रासायनिक lysosome समृद्ध और साइटोप्लाज्मिक भिन्न प्राप्त करने के लिए अलग कर रहे हैं। इन अंशों तो मैक्रोऑटोफैगी मार्करों (LC3b और p62) या proteasomal substrates (पॉली-सबबक्टिनाइज्ड प्रोटीन) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी blotting के माध्यम से समानांतर में विश्लेषण कर रहे हैं। समय के साथ, प्रोटीज़ अवरोधकों के साथ इंजेक्शन जानवरों प्रोटीन है कि आम तौर पर पुनर्नवीनीकरण किया गया होगा जमा. नतीजतन, कारोबार की दर protease-inhibitor इलाज नमूनों में मार्कर प्रोटीन की बहुतायत की तुलना द्वारा sham-treated नमूनों के लिए inferred है. दिन भर में निश्चित समय अंतराल पर इस विधि को दोहराने से प्रोटीओलिसिस में सर्कैडियन विविधताओं का पुनर्निर्माण करना संभव है (चित्र 1क)।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

सेल अवांछित प्रोटीन और अन्य सामग्री रीसाइक्लिंग के लिए कई तरीकों को रोजगार, लाइसोसोमल और गैर lysosomal रास्ते सहित. मुख्य लाइसोसोम-निर्भर मार्ग को स्वभोजी कहा जाता है, जबकि प्रोटीन कैटाबोलिज्म के लिए प्राथमिक गैर-लाइसोसोमल विधि सर्वव्यापक-प्रोटेसोम प्रणाली है। मॉडल जीवों में हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि दोनों autophagy और सर्वव्यापक प्रणाली की गतिविधि दिन भर में स्थिर नहीं है, लेकिन बजाय एक दैनिक (circadian) ताल के अनुसार बदलता है. प्रोटीन कारोबार में जैविक लय को मापने की क्षमता कैसे सेलुलर गुणवत्ता नियंत्रण हासिल की है और ब्याज की विशिष्ट प्रोटीन की गतिशीलता को समझने के लिए समझने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम vivo में autophagic और proteasomal प्रवाह है कि प्रोटीन कारोबार के circadian घटक कब्जा मात्रा के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हमारे प्रोटोकॉल माउस से निपटने के लिए विवरण शामिल, ऊतक प्रसंस्करण, प्रभाजन, और autophagic प्रवाह परिमाणीकरण शुरू सामग्री के रूप में माउस जिगर का उपयोग कर.

प्रतिनिधि आंकड़े 2A,Bमें प्रस्तुत किए गए हैं, और इन आंकड़ों का परिमाणीकरण चित्र 2C,D में प्रदान किया गया है (यह भी पूरक फ़ाइल "नमूना डेटा"देखें) में प्रदान किए जाते ह?...

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Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

हम autophagy और माउस जिगर में proteasome के माध्यम से प्रोटीन catabolism में जैविक लय को मापने के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन.

ऑटोफैगिक और प्रोटीसोमल फ्लक्स में दैनिक तालों को मापने

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

हमारा प्रोटोकॉल माउस ऊतकों में ऑटोफैगी और प्रोटेस्टोमल गतिविधि की दर को मापने की अनुमति देता है और इन गतिविधियों के भीतर सर्कैडियन विविधताओं का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है। इस तकनीक का उपयोग वीवो में कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन कैटाबोलिज्म का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है और आवश्यक सामग्री अपेक्षाकृत कम तकनीक और किसी भी आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला के लिए सुलभ है। प्रक्रिया का प्रदर्शन मिखाइल Ryzhikov, मेरी प्रयोगशाला से एक के बाद डॉक्टर होगा ।प्रत्येक समय बिंदु से पहले पंद्रह मिनट के लिए, कमरे के तापमान के लिए leupeptin और बोर्टेजोमिब स्टॉक समाधान गर्म करें और बाँझ पीबीएस में गल गए बोर्टेजोमिब को कमजोर करें ताकि 50 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर काम समाधान निकल सके। प्रोटीज अवरोधक प्रशासन के लिए, इंट्रापेरिटेली प्रत्येक प्रायोगिक जानवर में 40 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम ल्यूपेप्टिन या 1.6 माइक्रोग्राम प्रति किलोग्राम बोर्टेजोमिब इंजेक्ट करते हैं। एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए, पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर के साथ चूहों को इंजेक्ट करें।प्रत्येक माउस को प्राप्त उपचार के प्रकार द्वारा समूहीकृत पिंजरों में वापस करें क्योंकि उन्हें इंजेक्शन दिया जाता है और चूहों के इलाज या मानकीकृत तालिका में हेरफेर किए जाने वाले समय को रिकॉर्ड किया जाता है। इंजेक्शन के दो घंटे बाद, बर्फ पर उचित लेबल 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में बर्फ ठंडे समरूपता बफर के सात मिलीलीटर में प्रत्येक बलिदान प्रयोगात्मक जानवर से काटा बाएं जिगर पालि जलमग्न । जब सभी नमूनों का अधिग्रहण किया गया है, तो पहले नमूने और समरूप बफर की पूरी मात्रा को 15 मिलीलीटर क्षमता में स्थानांतरित करें Dounce समरूप और ढीले पिस्टन के 10 स्ट्रोक और तंग पिस्टन के 15 स्ट्रोक के साथ नमूना समरूप।परिणामी क्रूड समरूप को अपनी मूल ट्यूब पर लौटाएं और अगले नमूने को समरूप करें जैसा कि अभी प्रदर्शित किया गया है। जब सभी नमूनों को समरूप किया गया है, तो अपकेंद्रित्र द्वारा समरूप नाभिक और मलबे को तलछट करते हैं और प्रत्येक परमाणु सुपरनेट्टर के शीर्ष चार मिलीलीटर को नए 15 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करते हैं । मानक प्रोटोकॉल के अनुसार इस पहले सुपरनैटेंट अंश की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें और आवश्यक के रूप में ताजा समरूपता बफर के साथ 2.1 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के लिए सभी नमूनों की सांद्रता को बराबर करें।डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और गुणवत्ता सुधार के लिए, सामान्यीकृत कुल प्रोटीन अंशों के 500 माइक्रोलीटर शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में आते हैं। शेष कुल प्रोटीन अंशों में से प्रत्येक के 1.5 मिलीलीटर को व्यक्तिगत माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और प्रोटीन के नमूनों को अपकेंद्रित्र द्वारा गोली दें। परिणामस्वरूप दूसरे अंश सुपरनेटर के एक मिलीलीटर को बर्फ पर नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और शेष सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।3K छर्रों को प्रति वॉश ताजा ठंडे समरूप बफर के 1.5 मिलीलीटर में दो बार धोएं, फिर एसडीएस-पेज नमूना बफर के 200 माइक्रोलीटर में 3K गोली को फिर से रखें और नमूनों को पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें। दूसरे अंश को 20 मिनट के लिए 20, 000 x g और चार डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें और परिणामी तीसरे साइटोप्लाज्मिक अंश सुपरनेटेंट को एक नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए, 4x एसडीएस-पेज नमूना बफर के 50 माइक्रोलीटर के साथ साइटोप्लाज्मिक अंश के 150 माइक्रोलीटर को मिलाएं और साइटोप्लाज्मिक अंश के नमूनों को पांच मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें।20K छर्रों से शेष सुपरनेट को एस्पिरेट करें और नमूनों को दो बार ताजा ठंडे समरूपता बफर प्रति धोने के 1.5 मिलीलीटर के साथ धोएं। फिर पांच मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर उबलते के लिए SDS-पृष्ठ नमूना बफर के १०० माइक्रोलीटर में 20K गोली resuspend । पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए, क्रमिक रूप से मानक वक्र प्रोटीन को 1x नमूना बफर में कुल छह कमजोर करने के लिए एक से तीन को पतला करें और प्रत्येक मानक वक्र नमूने के 10 माइक्रोलीटर को 26 अच्छी तरह से चार से 12% एसडीएस-पेज मिडी जेल के एक कुएं में लोड करें, फिर एक पूर्व दागदार वाणिज्यिक आणविक वजन मानक लोड करें।ऑटोफैजिक फ्लक्स को मापने के लिए, प्रत्येक 3K गोली के नमूने के 12 माइक्रोलीटर को उपयुक्त कुओं में लोड करें। प्रोटेस्टोमल फ्लक्स को मापने के लिए, प्रत्येक साइटोप्लाज्मिक अंश के 12 माइक्रोलीटर को उपयुक्त कुओं में लोड करें। जब सभी नियंत्रण और प्रायोगिक नमूने लोड किए गए हैं, तो प्रोटीन को मानक प्रोटोकॉल के अनुसार पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड झिल्ली में स्थानांतरित करने से पहले एसडीएस-पेज द्वारा प्रोटीन नमूनों को अलग करें।मैक्रोऑटोफैजिक प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए, एंटी-पी62 या एंटी-एलसीबी एंटीबॉडी के साथ 3K गोली के नमूनों वाले दाग झिल्ली चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर। प्रोटेसोमल फ्लक्स का विश्लेषण करने के लिए, एंटी-lysine 48-विशिष्ट पॉली सर्वव्यापकाइन एंटीबॉडी के साथ साइटोप्लाज्मिक अंश नमूनों से युक्त दाग झिल्ली चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर। फिर मानक माध्यमिक एंटीबॉडी और इमेजिंग उपकरणों का उपयोग करके पश्चिमी ब्लॉट्स को इमेज करें।मानक वक्र और प्रयोगात्मक नमूनों दोनों के लिए ब्याज के बैंड पर घनत्व माप करने के लिए, एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें और झिल्ली के शीर्ष तक फैली दाग छवि के तल पर ब्याज के प्रोटीन मोनोमर को शामिल करते हुए एक लंबा आयत आकर्षित करें। आयत को शेष नमूनों में ले जाने के लिए प्रति और पेस्ट, नमूनों के बीच आयत को सुसंगत रखते हुए। क्वांटिफिकेशन को स्प्रेडशीट में सहेजें और एक बेहतरीन फिट मानक वक्र समीकरण प्राप्त करने के लिए या तो रैखिक या पॉलीनोमियल प्रतिगमन में क्रमिक रूप से पतला मानक नमूने का उपयोग करके स्प्रेडशीट के भीतर एक घनत्व मानक वक्र उत्पन्न करें।इस समीकरण का उपयोग करके, प्रायोगिक नमूनों के भीतर ब्याज के मोनोमर की मात्रा को एक्सट्रपलेट करें। फ्लक्स माप प्राप्त करने के लिए, एक ही समय बिंदु से पीबीएस नमूनों के औसत मूल्य से प्रत्येक अवरोधक उपचारित नमूने की एक्सट्रपलेटेड प्रोटीन मात्रा घटाएं। फिर एक तरह से ANOVA का उपयोग कर प्रोटीन कारोबार में लौकिक भिन्नता के सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करें ।किसी भी समय बिंदु पर ऑटोफैजिक फ्लक्स के लिए प्राथमिक रीडआउट दो द्वारा विभाजित लाइसोसोम-समृद्ध 3K गोली अंश में नकली नमूनों बनाम इलाज के बीच मैक्रोऑटोफैैगी विशिष्ट मार्कर की मात्रा में अंतर है। आमतौर पर, परिणामों को सामान्य रूप से मतलब है जो स्वतंत्र प्रयोगों में तुलना को सरल बनाता है। प्रोटेरोलिटिक फ्लक्स को मापने के लिए हमारी प्रक्रिया ऑटोफैगी और प्रोटेसोम सब्सट्रेट्स के संचय का कारण बनने के लिए ल्यूपेप्टिन या बोर्टेजोमिब की क्षमता पर निर्भर करती है, जो एक समय पर निर्भर करने वाली प्रक्रिया है।इस तकनीक ने कैसे जैविक लय कार्यक्रम जिगर प्रोटीन कैटाबोलिज्म की खोज की अनुमति दी है। हमें उम्मीद है कि इससे सेलुलर हाउसकीपिंग कार्यों पर बीमारी के प्रभावों की जांच का मार्ग प्रशस्त होगा ।

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