Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato da RO1HL135846 e da una sovvenzione dell'Istituto per lo sviluppo dei bambini (PD-II-2016-529).

Il protocollo qui descritto è stato approvato dalla Washington University in St. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Alloggiamento del mouse e progettazione sperimentale
<ol><li>Per rilevare i ritmi giornalieri nel turnover delle proteine, i topi domestici (maschio o femmina C57BL/6J, 4-8 settimane di età, 20-25 g) secondo i cicli di luce/oscurità standard 12 h con cibo fornito ad libitum. Per evitare di stressare gli animali, acclimatarsi per almeno una settimana nel...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

Il nostro protocollo descrive un mezzo tecnicamente semplice per misurare i ritmi biologici nel turnover delle proteine nei topi utilizzando attrezzature di biologia molecolare comunemente disponibili. A causa della durata degli esperimenti di serie temporali e del numero di campioni biologici coinvolti, è importante essere coerenti nell'intero esperimento per quanto riguarda l'iniettazione dei topi, i tempi di acquisizione dei tessuti e l'elaborazione biochimica di Campioni. Le fasi di iniezione, eutanasia e dislocazio...

I ritmi circadiani si riferiscono a variazioni giornaliere prevedibili nella funzione biologica che sono evidenti in tutta la natura. Esistono ad ogni scala biologica, da comportamenti macroscopici come i cicli sonno-veglia, a fenomeni molecolari come l'abbondanza ritmica di biomolecole. Negli ultimi anni, la ricerca sui ritmi circadiani è stata trasformata dalla scoperta di "geni dell'orologio" che sono critici per la generazione di ritmi circadiani. Studi sui topi knockout genici dell'orologio hanno rivelato un ruolo centrale per i ritmi circadiani nell'organizzare temporaneamente i processi cellulari di base come il metabolismo1. Tra i modi in cui i ritmi circadiani fanno questo accadere è impartire una struttura temporale al catabolismo proteico.
Diversi gruppi tra cui il nostro hanno dimostrato che le due principali vie per il catabolismo cellulare proteico, l'autofagia e il sistema ubiquitina-proteasoma, sono soggette a ritmi diurni2,3,4,5. L'autofagia rappresenta il braccio lisoso-dipendente del catabolismo proteico in cui le proteine di interesse vengono consegnate a questo organello degradante sia attraverso la costruzione di un nuovo vescicolo (macroautofagia) sia attraverso la traslocazione diretta canale (chaperone mediato autofagia)6. Il sistema ubiquitina-protasosoma è la principale via non lisomica, dove le proteine sono poli-ubiquitinate e poi alimentate nel proteasome, una macchina degradativa macromolecolare trovata in tutto il citoplasma e nucleo7,8. I ritmi nell'attività autofagica e proteasomica sono importanti perché probabilmente svolgono un ruolo nella pulizia cellulare. Di conseguenza, è importante avere una procedura standardizzata in grado di rilevare le oscillazioni giornaliere nel catabolismo proteico che è compatibile con i modelli di malattia pre-clinica.
Qui, forniamo il nostro protocollo per quantificare le variazioni diurne nel flusso autofagico nel fegato di topo, che è servito come base per il lavoro nel nostro laboratorio3,9. Il nostro metodo è classificato come un "asay di turnover"10, un approccio utilizzato da numerosi gruppi per misurare l'attività proteolitica (o flusso). In questo approccio, gli inibitori della proteasi specifici dei lisosomi o proteasomi vengono somministrati ai topi e quindi i campioni di tessuto vengono ottenuti dopo un intervallo di tempo fisso. Parallelamente, i campioni di tessuto sono ottenuti da topi sottoposti a iniezioni fittizie. I campioni di tessuto vengono omogeneizzati e poi separati biochimicamente per ottenere le frazioni arricchite e citoplasmase arricchite dal lisosomia. Queste frazioni vengono quindi analizzate in parallelo tramite gonfiore occidentale utilizzando anticorpi specifici per marcatori macroautofagia (LC3b e p62) o substrati proteasomici (proteina poli-ubiquitinated). Nel corso del tempo, gli animali iniettati con inibitori della proteasi accumulano proteine che normalmente sarebbero state riciclate. Di conseguenza, il tasso di rotazione viene dedotto confrontando l'abbondanza di proteine marcatore nei campioni trattati con proteasi-inibizionista con i campioni trattati con finta. Ripetendo questo metodo a intervalli di tempo fissi nel giorno è possibile ricostruire le variazioni circadiane nella proteolisi (Figura 1A).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

Le cellule impiegano diversi metodi per riciclare proteine indesiderate e altro materiale, tra cui vie lisosomiali e non lisosomiche. Il principale percorso dipendente dal lisosoma è chiamato autofagia, mentre il metodo primario non lisosomico per il catabolismo proteico è il sistema ubiquitina-proteasome. Recenti studi su organismi modello suggeriscono che l'attività sia dell'autofagia che del sistema ubiquitina-proteasoma non è costante per tutto il giorno, ma varia invece in base a un ritmo quotidiano (circadiano). La capacità di misurare i ritmi biologici nel turnover delle proteine è importante per comprendere come si ottiene il controllo della qualità cellulare e per comprendere le dinamiche di specifiche proteine di interesse. Qui presentiamo un protocollo standardizzato per quantificare il flusso autofagico e proteasomico in vivo che cattura la componente circadiana del turnover delle proteine. Il nostro protocollo include dettagli per la movimentazione del mouse, l'elaborazione dei tessuti, la frazione e la quantificazione del flusso autofagico utilizzando il fegato di topo come materiale di partenza.

I dati rappresentativi sono presentati nella Figura 2A,Be la quantificazione di questi dati sono forniti nella Figura 2C,D (vedere anche il file supplementare "Dati di esempio"). Per semplicità, non è stato descritto il caricamento di controlli in Figura 2, ma questi devono essere ottenuti in parallelo. Tipicamente, le macchie occidentali contro l'atto di z-actin sono utilizzate p...

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Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Descriviamo il nostro protocollo per la misurazione dei ritmi biologici nel catabolismo proteico tramite l'autofagia e il proteasome nel fegato di topo.

Misurazione dei ritmi diurni nel flusso autofagico e proteasomico

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Il nostro protocollo consente di misurare la velocità di autofagia e attività proteasomale nei tessuti dei topi ed è abbastanza sensibile da rilevare variazioni circadiane all'interno di queste attività. Questa tecnica può essere utilizzata in vivo per valutare il catabolismo proteico in cellule e tessuti e i materiali richiesti sono relativamente a bassa tecnologia e accessibili a qualsiasi laboratorio di biologia molecolare. A dimostrare la procedura sarà Mikhail Ryzhikov, un post-doc del mio laboratorio.Per quindici minuti prima di ogni punto di tempo, scaldare le soluzioni stock di leupeptina e bortezomib a temperatura ambiente e diluire il bortezomib scongelato in PBS sterile per produrre una soluzione di lavoro da 50 milligrammi per millilitro. Per la somministrazione dell'inibitore della proteasi, iniettare per via intraperitoneale 40 milligrammi per chilogrammo di leupeptina o 1,6 microgrammi per chilogrammo di bortezomib in ciascun animale sperimentale. Per un controllo negativo, iniettare topi con 0,5 millilitri di PBS.Riportare ogni topo in gabbie raggruppate per il tipo di trattamento ricevuto man mano che vengono iniettati e registrare il tempo in cui i topi vengono trattati o manipolati in una tabella standardizzata. Due ore dopo l'iniezione, immergere il lobo epatico sinistro raccolto da ogni animale sperimentale sacrificato in sette millilitri di tampone di omogeneizzazione a freddo ghiacciato in tubi conici da 15 milliliter opportunamente etichettati sul ghiaccio. Una volta acquisiti tutti i campioni, trasferire il primo campione e l'intero volume del buffer di omogeneizzazione in un omogeneizzatore Dounce da 15 millilitri e omogeneizzare il campione con 10 tratti del pistone allentato e 15 tratti del pistone stretto.Riportare l'omogeneato grezzo risultante nel suo tubo originale e omogeneizzare il campione successivo come appena dimostrato. Una volta omogeneizzati tutti i campioni, sedimentare i nuclei e i detriti omogeneizzati mediante centrifugazione e trasferire i primi quattro millilitri di ogni supernatante post-nucleare in nuovi tubi da 15 millilitri. Determinare la concentrazione proteica di questa prima frazione supernatante secondo protocolli standard ed equalizzare le concentrazioni di tutti i campioni a 2,1 milligrammi per millilitro con tampone di omogeneizzazione fresco, se necessario.Per l'analisi a valle e il miglioramento della qualità, aliquota 500 microlitri delle frazioni proteiche totali normalizzate in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per meno 80 gradi Celsius. Trasferire 1,5 millilitri di ciascuna delle restanti frazioni proteiche totali in singoli tubi di microcentrifugo e pelletare i campioni proteici mediante centrifugazione. Trasferire un millilitro dei supernatanti della seconda frazione risultanti in nuovi tubi di microcentrifugo sul ghiaccio e aspirare i supernatanti rimanenti.Lavare i pellet 3K due volte in 1,5 millilitri di tampone fresco di omogeneizzazione a freddo per lavaggio, quindi risospendare il pellet 3K in 200 microlitri di tampone campione SDS-PAGE e far bollire i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Ruotare i supernatanti della seconda frazione per 20 minuti a 20.000 x g e quattro gradi Celsius e trasferire i supernatanti della terza frazione citoplasmatica risultanti in un nuovo tubo di microcentrifugo. Per l'analisi SDS-PAGE, combinare 150 microlitri della frazione citoplasmatica con 50 microlitri di tampone campione 4x SDS-PAGE e far bollire i campioni di frazione citoplasmatica a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Aspirare il supernatante rimanente dai pellet 20K e lavare i campioni due volte con 1,5 millilitri di tampone fresco di omogeneizzazione a freddo per lavaggio. Quindi rimospendare il pellet 20K in 100 microlitri di tampone campione SDS-PAGE per l'ebollizione a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Per l'analisi western blot, diluire serialmente le proteine della curva standard da uno a tre in 1x tampone campione per un totale di sei diluizioni e caricare 10 microlitri di ogni campione di curva standard in un pozzo di un gel midi da 26 ben quattro a 12%SDS-PAGE, quindi caricare uno standard di peso molecolare commerciale prestained.Per misurare il flusso autofagico, caricare 12 microlitri di ogni campione di pellet 3K nei pozzi appropriati. Per misurare il flusso proteasomale, caricare 12 microlitri di ogni frazione citoplasmatica nei pozzi appropriati. Una volta caricati tutti i campioni di controllo e sperimentali, separare i campioni proteici da SDS-PAGE prima di trasferire le proteine su membrane fluorurate di polivinilidene secondo protocolli standard.Per l'analisi del flusso macroautofagico, le membrane macchie contenenti i campioni di pellet 3K con anticorpo anti-p62 o anti-LcB durante la notte a quattro gradi Celsius. Per l'analisi del flusso proteasomale, le membrane macchie contenenti i campioni di frazione citoplasmatica con anticorpo poli ubiquitina anti-lisina 48-specifico durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi immagini le macchie occidentali usando anticorpi secondari standard e dispositivi di imaging.Per eseguire misurazioni densitometriche su bande di interesse sia per la curva standard che per i campioni sperimentali, aprire un programma software di analisi delle immagini appropriato e disegnare un lungo rettangolo che comprenda il monomero proteico di interesse nella parte inferiore dell'immagine macchiata che si estende fino alla parte superiore della membrana. Copiare e incollare per spostare il rettangolo negli esempi rimanenti, mantenendo il rettangolo coerente tra i campioni. Salvare la quantificazione in un foglio di calcolo e generare una curva standard densitometrica all'interno del foglio di calcolo utilizzando il campione standard diluito in serie nella regressione lineare o polinomiale per ottenere un'equazione di curva standard più adatta.Usando questa equazione, estrapolare la quantità dei monomeri di interesse all'interno dei campioni sperimentali. Per ottenere misurazioni del flusso, sottrarre la quantità proteica estrapolata di ciascun campione trattato dall'inibitore dal valore medio dei campioni PBS dallo stesso punto di tempo. Quindi valutare la significatività statistica della variazione temporale nel turnover proteico utilizzando ANOVA unizionale.La lettura primaria per il flusso autofagico in un dato punto di tempo è la differenza nella quantità di marcatori specifici di macroautofagia tra la leupeptina trattata rispetto ai campioni fittizi nella frazione di pellet 3K arricchita di lisosomi diviso per due. Tipicamente, i risultati sono normalizzati alla media che semplifica il confronto tra esperimenti indipendenti. La nostra procedura per misurare il flusso proteolitico dipende dalla capacità della leupeptina o del bortezomib di causare l'accumulo di autofagia e substrati proteasome, che è un processo dipendente dal tempo.Questa tecnica ha permesso di esplorare come i ritmi biologici programmano il catabolismo proteico epatico. Speriamo che spianerà la strada allo studio degli effetti della malattia sulle funzioni di pulizia cellulare.

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