Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
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この研究は、RO1HL135846と児童開発研究所の助成金(PD-II-2016-529)によって資金提供されました。

ここに記載されているプロトコルは、セントルイス動物ケアと使用委員会(IACUC)のワシントン大学によって承認されました。
1. マウスハウジングと実験設計
<ol><li>タンパク質回転率の毎日のリズムを検出するために、ハウスマウス(雄または女性C57BL/6J、4−8週齢、20−25g)の標準的な12時間の光/暗いサイクルの下で、食物提供のアドリビタムを提供する。動物にスト...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

我々のプロトコルは、一般的に利用可能な分子生物学装置を使用してマウスのタンパク質回転率の生物学的リズムを測定する技術的に簡単な手段を説明する。時系列実験の長さと関連する生物学的サンプルの数のために、マウスの注入方法、組織獲得のタイミングおよび生化学的処理に関する実験全体で一貫性を保ることが重要である。サンプル。注射、安楽死、頸部脱臼のステップは、本?...

概日リズムは、自然全体で明らかな生物学的機能の毎日の予測可能な変動を指します。睡眠覚醒サイクルのようなマクロ的な行動から、生体分子のリズミカルな豊富さのような分子現象まで、あらゆる生物学的規模で存在します。近年、概日リズム生成に不可欠な「クロック遺伝子」の発見により、概日リズムの研究が変容しています。クロック遺伝子ノックアウトマウスの研究は、代謝1などのコア細胞プロセスを一時的に組織化する概日リズムの中心的な役割を明らかにした。概日リズムがこれを実現する方法の中で、タンパク質異化に時間構造を与えることによってです。
我々を含むいくつかのグループは、細胞タンパク質異化症、オートファジーおよびユビキチンプロテアソーム系の2つの主要な道が、日次リズム2、3、4、5の対象となることを示している。オートファジーは、目的のタンパク質が新規小胞(マクロオートファジー)の構築を通じて、または直接転移を通じてこの劣化小器官に送達されるタンパク質異化のリソソーム依存性アームを表す。チャネル(シャペロン媒介オートファジー)6.ユビキチン・プロテアソーム系は、タンパク質がポリユビキチン化され、プロテアソームに送り込まれる主要な非リソソーム経路であり、細胞質および核7、8全体で見られる高分子分解機である。オートファジーとプロテアソーム活性のリズムは、細胞のハウスキーピングに役割を果たす可能性が高いので重要です。その結果、前臨床疾患モデルと互換性のあるタンパク質異化の日常的な振動を検出できる標準化された手順を持つことは貴重です。
ここでは、研究室3,9の研究の基礎となっているマウス肝臓のオートファギックフラックスの日常的変動を定量化するためのプロトコルを提供します。我々の方法は、「ターンオーバーアッセイ」10、多くのグループがプロテオ溶解活性(またはフラックス)を測定するために使用されるアプローチとして分類される。このアプローチでは、リソソームまたはプロテアソームに特異的なプロテアーゼ阻害剤をマウスに投与し、その後、組織サンプルが一定の時間間隔後に得られる。並行して、組織サンプルは、シャム注射を行ったマウスから得られる。組織サンプルを均質化し、生化学的に分離し、リソソーム富化および細胞質画分を得る。これらの画分は、マクロオートファジーマーカー(LC3bおよびp62)またはプロテアソーム基質(ポリユビキチン化タンパク質)に特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングを介して並行して分析される。時間が経つにつれて、プロテアーゼ阻害剤を注射された動物は、通常リサイクルされるであろうタンパク質を蓄積します。その結果、ターンオーバー率は、プロテアーゼ阻害剤処理されたサンプル中のマーカータンパク質の豊富さをシャム処理サンプルと比較することによって推測される。この方法を1日を通して一定の時間間隔で繰り返すことにより、プロテオ分解における概日変動を再構築することができる(図1A)。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

細胞は、リソソームおよび非リソソーム経路を含む不要なタンパク質および他の材料をリサイクルするためのいくつかの方法を採用しています。主なリソソーム依存性経路はオートファジーと呼ばれ、タンパク質異化症の主要な非リソソーム法はユビキチンプロテアソーム系である。モデル生物の最近の研究は、オートファジーとユビキチンプロテアソームシステムの両方の活性が一日を通して一定ではなく、代わりに毎日(概日)リズムに応じて変化することを示唆しています。タンパク質回転率の生体リズムを測定する能力は、細胞の品質管理がどのように達成されるかを理解し、目的の特定のタンパク質のダイナミクスを理解するために重要です。ここでは、タンパク質回転率の概日成分を捕捉する生体内でオートプハギックおよびプロテアソームフラックスを定量するための標準化されたプロトコルを提示する。当社のプロトコルには、マウスの取り扱い、組織処理、分画、およびマウス肝臓を出発材料として使用したオートファギックフラックス定量の詳細が含まれています。

代表的なデータを図2A,Bに示し、これらのデータの定量化を図2C,Dに示します(補足ファイル「サンプルデータ」も参照)。わかりやすくするために、図 2にローディング コントロールを示していませんが、これらは並行して取得する必要があります。典型的には、β-アクチンに対するウェス...

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Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

オートファジーとマウス肝臓のプロテアソームを介してタンパク質異化の生体リズムを測定するための我々のプロトコルを説明する.

オートプハギックとプロテアソームフラックスにおける日のリズムの測定

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

我々のプロトコルは、マウス組織におけるオートファジーおよびプロテアソーム活性の速度を測定することを可能にし、これらの活動内の概日変動を検出するのに十分な感度である。この技術は、細胞および組織におけるタンパク質の同化作用を評価するために生体内で使用することができ、必要な材料は比較的低技術であり、任意の分子生物学研究室にアクセス可能である。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターであるミハイル・リジコフです。各タイムポイントの前に15分間、ロイペプチンとボルテゾミブのストック溶液を室温まで温め、解凍したボルテゾミブを無菌PBSで希釈して1ミリリットル当たり50ミリグラムの作業溶液を得る。プロテアーゼ阻害剤投与の場合、腹腔内は1キログラム当たり40ミリグラムのロイペプチンまたはボルテゾミブ1キログラム当たり1.6マイクログラムを各実験動物に注入する。陰性コントロールの場合は、0.5ミリリットルのPBSでマウスを注射します。各マウスを注入時に受けた治療の種類別にグループ化されたケージに戻し、標準化されたテーブルでマウスが治療または操作された時間を記録します。注射の2時間後、各犠牲実験動物から採取した左肝葉を氷上の15ミリリットル円錐形管に適当に標識した氷冷均質化バッファーの7ミリリットルに沈水する。すべてのサンプルが取得されたら、最初のサンプルとホモジナイゼーションバッファーの全容を15ミリリットル容量のDounceホモジナイザーに移し、緩いピストンの10ストロークとタイトピストンの15ストロークでサンプルを均質化します。結果として得られた粗ホモゲンを元のチューブに戻し、ちょうど実証したように次のサンプルを均質化します。すべてのサンプルが均質化されたら、遠心分離によってホモジネート核および破片を沈降させ、各核後上清の上位4ミリリットルを新しい15ミリリットルのチューブに移す。標準プロトコルに従ってこの最初の上清分の割合のタンパク質濃度を決定し、必要に応じて新鮮な均質化バッファーで1ミリリットル当たり2.1ミリグラムにすべてのサンプルの濃度を均等にします。下流の分析と品質改善のために、正規化された全タンパク質分率の500マイクロリットルをマイナス80°Cの貯蔵用に1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管にアリコートした。残りの全タンパク質分画の1.5ミリリットルを個々のマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離によってタンパク質サンプルをペレットにします。得られた第2分の上清の1ミリリットルを氷上の新しいマイクロ遠心分離管に移し、残りの上清を吸引する。3Kペレットを1回の新鮮な冷たい均質化バッファーで1.5ミリリットルで2回洗浄し、SDS-PAGEサンプルバッファーの200マイクロリットルで3Kペレットを再中断し、サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。20、000 x g、摂氏4度で20分間、2分目の上澄み物を回転させ、得られた第3細胞質分画上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。SDS-PAGE分析では、細胞質分画の150マイクロリットルを4x SDS-PAGEサンプルバッファーの50マイクロリットルと組み合わせ、細胞質分率サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。20Kペレットから残りの上清を吸引し、1回の洗浄ごとに新鮮な冷ホ均質化バッファーの1.5ミリリットルでサンプルを2回洗浄します。その後、摂氏95度で5分間沸騰させるSDS-PAGEサンプルバッファーの100マイクロリットルに20Kペレットを再懸濁します。ウェスタンブロット分析では、標準曲線タンパク質を1xサンプルバッファーに1~3個ずつ連続希釈して合計6回の希釈液をサンプリングし、各標準曲線サンプルの10マイクロリットルを26ウェル4~12%SDS-PAGEミディゲルの1つのウェルにロードし、先取りした市販の分子量標準をロードします。オートファガスフラックスを測定するには、各3Kペレットサンプルの12マイクロリットルを適切なウェルにロードする。プロテアソームフラックスを測定するために、各細胞質分画の12マイクロリットルを適切なウェルにロードする。すべての制御サンプルと実験サンプルがロードされたら、標準的なプロトコルに従ってタンパク質をポリビニリデンフッ化物膜に移す前に、SDS-PAGEによってタンパク質サンプルを分離します。マクロオートファギスフラックスを分析するために、抗p62または抗LcB抗体を摂氏4度で一晩に3Kペレットサンプルを含むブロット膜。プロテアソームフラックスを解析するために、細胞質画分試料を48特異的ポリユビキチン抗体で一晩摂氏4度で含有するブロット膜。次に、標準の二次抗体およびイメージングデバイスを使用して、ウェスタンブロットを画像化します。標準曲線と実験サンプルの両方に関する目的のバンドに対して密度測定を行うために、適切な画像解析ソフトウェアプログラムを開き、膜の上部に伸びるブロット画像の下部に目的のタンパク質モノマーを包含する長い長方形を描きます。コピーして貼り付けて、残りのサンプルに四角形を移動し、サンプル間で一定の四角形を保持します。スプレッドシートに定量を保存し、線形または多項式回帰で逐次希釈された標準サンプルを使用してスプレッドシート内に密度標準曲線を生成し、最適な標準曲線方程式を得ます。この式を使用して、実験サンプル内の目的のモノマーの量を推定する。フラックス測定を得るために、各阻害剤処理サンプルの外挿タンパク質量を同じタイムポイントからPBSサンプルの平均値から差し引く。次に、一方向の分散分析を用いて、タンパク質のターンオーバーにおける時間的変動の統計的有意性を評価する。任意の時点におけるオートファジーフラックスの一次読出しは、リソソーム濃縮された3Kペレット分画で処理されたロイペプチンと偽のサンプルとの間のマクロオートファジー特異的マーカーの量の差を2で割った値である。通常、結果は、独立した実験間の比較を簡素化する平均に正規化されます。タンパク質分解フラックスの測定方法は、時間依存のプロセスであるオートファジーおよびプロテアソーム基質の蓄積を引き起こすロイペプチンまたはボルテゾミブの能力に依存します。この技術は、生物学的リズムが肝臓タンパク質同化作用をプログラムする方法の探求を可能にしました。この病気が細胞のハウスキーピング機能に及ぼす影響を調査する道が開かれることを期待しています。

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