Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
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이 작품은 RO1HL135846과 어린이 개발 연구소 보조금 (PD-II-2016-529)에 의해 지원되었다.

여기에 설명된 프로토콜은 세인트 루이스 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 워싱턴 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 하우징 및 실험 설계
<ol><li>단백질 회전율에서 매일 리듬을 검출하기 위해, 집 마우스 (남성 또는 여성 C57BL / 6J, 4−8 주, 20-25 g) 표준 에서 12 시간 빛 / 어두운 주기 음식 제공 광고 리비텀. 동물에게 스트레스를 주는 것을 피하기 위해, 사용하기 ?...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

우리의 프로토콜은 일반적으로 이용 가능한 분자 생물학 장비를 사용하여 마우스에 있는 단백질 회전율에 있는 생물학 리듬을 측정하는 기술적으로 간단한 수단을 기술합니다. 시간차등의 실험의 길이와 관련된 생물학적 샘플의 수로 인해 마우스가 주입되는 방법, 조직 획득 시기 및 생화학 적 처리에 관한 전체 실험에서 일관성을 두는 것이 중요합니다. 샘플. 주사, 안락사 및 자궁 경부 탈구 단...

Circadian 리듬은 자연 전체에 걸쳐 명백한 생물학적 기능에 있는 매일, 예측 가능한 변이를 참조합니다. 그(것)들은 모든 생물학 규모에서, 잠 각성 주기 같이 거시적인 행동에서, 생체 분자의 리듬 풍부 같이 분자 현상에, 존재합니다. 최근 몇 년 동안, circadian 리듬에 대 한 연구는 circadian 리듬 생성에 대 한 중요 한 "시계 유전자"의 발견에 의해 변환 되었습니다. 시계 유전자 녹아웃 마우스에 있는 연구 결과는 물질 대사와 같은 핵심 세포 프로세스를 시간적으로 조직하는 circadian 리듬을 위한 중앙 역할을 밝혔습니다1. circadian 리듬이 이것을 일어나는 방법 중 단백질 이화작용에 시간구조를 부여하여입니다.
당사를 포함한 여러 그룹은 세포 단백질 이화작용, 자가포식 및 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 위한 두 가지 주요 경로가 일주 리듬2,3,4,5의영향을 받는다는 것을 보여주었습니다. Autophagy는 관심있는 단백질이 열화 세포기관에 전달되는 단백질 이화 작용의 리소좀 의존팔을 나타내며, 이는 새로운 소포(macroautophagy)의 시공을 통해 또는 직접적인 전좌를 통해 전달됩니다. 채널 (샤페론 중재 autophagy)6. 유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 단백질이 폴리-유비퀴틴화되고 프로테아솜으로 공급되는 주요 비리소솜 통로이며, 세포질과 핵7,8에서발견되는 거대 분자 분해 기계이다. 자동 및 프로테아소말 활동의 리듬은 세포 하우스키핑에 중요한 역할을 할 가능성이 있기 때문입니다. 그 결과, 전임상 질환 모델과 호환되는 단백질 이화작용의 일일 진동을 감지할 수 있는 표준화된 절차를 하는 것이 중요합니다.
여기에서, 우리는 우리의 실험실3,9에서일의 기초로 봉사한 마우스 간에서 autophagic 유속에 있는 일변을 정량화하기 위한 우리의 프로토콜을 제공합니다. 우리의 방법은 "회전율 분석"10,프로테오리틱 활성(또는 플럭스)을 측정하기 위해 수많은 그룹에서 사용하는 접근법으로 분류된다. 이러한 접근법에서, 리소좀 또는 프로테아좀에 특이적인 프로테아제 억제제는 마우스에 투여되고 그 후 조직 샘플은 고정된 시간 간격 후에 수득된다. 병렬로, 조직 샘플은 가짜 주사를 행한 마우스로부터 수득된다. 조직 샘플은 균질화한 다음 생화학적으로 분리되어 리소좀이 농축되고 세포질 분획을 수득합니다. 이 분획은 그 때 macroautophagy 마커 (LC3b 및 p62) 또는 proteasomal 기질 (poly-ubiquitated 단백질)에 특이적인 항체를 사용하여 서쪽 blotting를 통해 병렬로 분석됩니다. 시간이 지남에 따라 프로테아제 억제제가 주입된 동물은 일반적으로 재활용되었을 단백질을 축적합니다. 그 결과, 프로테아제 억제제 처리 된 샘플에서 마커 단백질의 풍부를 샴 처리 샘플과 비교하여 회전율의 비율을 추론합니다. 하루 에 걸쳐 고정 된 시간 간격으로이 방법을 반복함으로써 프로테오 리시스(그림 1A)에서circadian 변이를 재구성 할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

세포는 리소좀 및 비 리소좀 경로를 포함하여 원치 않는 단백질 및 기타 물질을 재활용하는 여러 가지 방법을 사용합니다. 주요 리소좀 의존적 통로는 autophagy에게 불리고, 단백질 이화작용에 대한 1 차적인 비 리소좀 방법은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템입니다. 모형 유기체에 있는 최근 연구 결과는 autophagy와 유비퀴틴 proteasome 시스템의 활동이 하루 에 걸쳐 일정하지 않다는 것을 건의합니다 그러나 대신 매일 (circadian) 리듬에 따라 변화합니다. 단백질 회전율에 있는 생물학 리듬을 측정하는 기능은 세포 질 통제가 어떻게 달성되는지 이해하고 관심 있는 특정 단백질의 역학을 이해하기 를 위해 중요합니다. 여기에서 우리는 단백질 회전율의 circadian 분대를 붙잡는 생체 내 자동 파기 및 proteasomal 플럭스를 정량화하기 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 당사의 프로토콜에는 마우스 처리, 조직 처리, 분획 및 마우스 간을 원료로 사용하는 자가 유속 정량화에 대한 세부 정보가 포함됩니다.

대표 데이터는 그림 2A, B에표시되고, 이러한 데이터의 정량화는 그림 2C,D에서 제공됩니다 (보충 파일 "샘플 데이터"참조). 간단히 하기 위해 그림 2에서 로드 컨트롤을 묘사하지 는 않았지만 병렬로 가져와야 합니다. 전형적으로, β-액틴에 대하여 서쪽 얼룩은 이 목적을 위해 이용됩니다, 그러...

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Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

우리는 autophagy및 마우스 간에서 proteasome를 통해 단백질 이화 작용에 있는 생물학 리듬을 측정하기 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다.

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

우리의 프로토콜은 마우스 조직에서 자가 식 및 족피 활동의 속도를 측정 할 수 있으며 이러한 활동 내에서 circadian 변화를 감지 할 만큼 민감합니다. 이 기술은 세포와 조직에서 단백질 이화작용을 평가하기 위하여 생체 내에서 이용될 수 있고 필요한 물질은 상대적으로 낮은 기술이고 어떤 분자 생물학 실험실든지에 접근하기 쉽습니다. 절차를 시연하는 것은 미하일 Ryzhikov, 내 실험실에서 포스트 닥터가 될 것입니다.각 시간 시간 전에 15분 동안 leupeptin 및 bortezomib 스톡 솔루션을 실온으로 데우고 멸균 PBS의 해동 된 bortezomib을 희석하여 밀리리터 작업 용액당 50 밀리그램을 산출하십시오. 프로테아제 억제제 투여의 경우, 각 실험 동물에 1킬로그램당 40밀리그램 또는 1.6 마이크로그램의 루페프틴을 주입합니다. 부정적인 제어를 위해, PBS의 0.5 밀리리터와 마우스를 주입.각 마우스를 주입된 처리의 모형에 의해 그룹화된 케이지로 돌려보내고 마우스가 표준화된 표에서 처리되거나 조작되는 시간을 기록합니다. 주입 후 2시간 후, 얼음에 15밀리리터 원추형 튜브를 적절히 라벨으로 붙인 7밀리리터의 얼음 냉균질화 완충제에서 각 희생된 실험동물로부터 수확된 좌간 엽을 침수한다. 모든 시료를 획득하면, 첫 번째 샘플과 전체 균질화 버퍼를 15 밀리리터 용량 Dounce 균질화로 옮기고 10스트로크의 느슨한 피스톤과 15개의 타이트한 피스톤스트로크로 샘플을 균질화한다.결과 된 원유 균질화를 원래 튜브로 되돌리고 방금 입증 된 대로 다음 샘플을 균질화하십시오. 모든 시료가 균질화되었을 때, 퇴적물 동형 핵과 파편원심분리에 의한 핵과 파편을 원심분리하고 핵 후 상류체의 상위 4개 밀리리터를 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. 표준 프로토콜에 따라 이 첫 번째 상체 분획의 단백질 농도를 결정하고 필요에 따라 모든 시료의 농도를 밀리리터당 2.1 밀리그램으로 균질화합니다.다운스트림 분석 및 품질 개선을 위해 정규화된 총 단백질 분획의 500마이크로리터를 영하 80도 의 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 제공합니다. 개별 미세 원심 분리 튜브로 나머지 총 단백질 분획의 각각 1.5 밀리리터를 전달하고 원심분리에 의한 단백질 샘플을 펠릿으로 옮긴다. 결과 두 번째 분획 수퍼나티의 1밀리리터를 얼음에 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고 나머지 슈퍼나티를 흡인시합니다.세척당 신선한 냉균질화 버퍼 1.5 밀리리터에서 3K 펠릿을 두 번 세척한 다음 SDS-PAGE 샘플 버퍼 200 마이크로리터에서 3K 펠릿을 다시 중단하고 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다. 20, 000 x g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 두 번째 분수 슈퍼 네이너티드를 회전시키고 결과 세 번째 세포질 분획 슈퍼나티를 새로운 미세 센트심분리기 튜브로 옮긴다. SDS-PAGE 분석을 위해 세포질 분획의 150마이크로리터를 4x SDS-PAGE 샘플 버퍼 50마이크로리터와 결합하고 세포질 분수 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.20K 펠릿에서 남은 상체를 흡인하고 세척당 신선한 냉동균화 버퍼 1.5 밀리리터로 샘플을 두 번 세척합니다. 그런 다음 SDS-PAGE 샘플 버퍼 100마이크로리터에서 20K 펠릿을 5분 동안 섭씨 95도에서 끓여보세요. 서부 블롯 분석을 위해, 표준 곡선 단백질을 1x 샘플 버퍼에서 1~3개씩 연속적으로 희석하여 총 6개의 희석제에 대해, 각 표준 곡선 샘플의 10마이크로리터를 26웰 중 1개의 SDS-PAGE 미디 젤로 로드한 다음, 선행 상용 분자량 표준을 로드합니다.자가플럭스를 측정하려면 각 3K 펠릿 샘플의 12마이크로리터를 적절한 우물에 적재합니다. 프로테소피플록을 측정하려면 각 세포질 분획의 12마이크로리터를 적절한 우물에 적재합니다. 모든 제어 및 실험 샘플이 적재되었을 때, 표준 프로토콜에 따라 폴리 비닐리덴 불소 막으로 단백질을 전송하기 전에 SDS-PAGE에 의해 단백질 샘플을 분리한다.거시토파지 플럭스를 분석하기 위해, 항p62 또는 항 LcB 항체를 함유한 3K 펠릿 샘플을 포함하는 블로트 멤브레인이 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 있다. 프로테소말 플럭스를 분석하기 위해, 항 리신 48 특이폴리 유비퀴틴 항체를 함유한 세포질 분획 시료를 함유한 블로트 멤브레인은 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 있다. 그런 다음 표준 이차 항체 및 이미징 장치를 사용하여 서부 블롯을 이미지화합니다.표준 곡선과 실험 샘플 모두에 대한 관심 있는 대역에서 밀도 측정을 수행하려면 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 멤브레인의 맨 위로 확장되는 블롯 이미지의 하단에 관심 있는 단백질 단조량을 포함하는 긴 사각형을 그립니다. 복사하여 붙여넣기하여 사각형을 나머지 샘플로 이동하여 사각형을 샘플 간에 일관되게 유지합니다. 정량화를 스프레드시트에 저장하고 선형 또는 다항회귀에서 직렬 희석된 표준 샘플을 사용하여 스프레드시트 내에서 밀도 표준 곡선을 생성하여 가장 적합한 표준 곡선 방정식을 얻습니다.이 방정식을 사용하여 실험 샘플 내에서 관심 있는 단량의 양을 추정합니다. 플럭스 측정을 얻으려면 PBS 샘플의 평균 값에서 처리된 각 억제제 샘플의 추정 단백질 양을 동일한 시점에서 빼는다. 그런 다음 단방향 ANOVA를 사용하여 단백질 회전율에 있는 측두변의 통계적 유의를 평가합니다.주어진 시점에서 자가식 플럭스를 위한 1차 판독은 리소좀 농축 된 3K 펠릿 분획에서 샴 샘플대 처리된 류페틴 사이의 대식체식파지 특이적 마커의 양에 차이가 있다. 일반적으로 결과는 독립적인 실험 전반에 걸쳐 비교를 단순화하는 평균으로 정규화됩니다. 프로테올리틱 플럭스를 측정하는 당사의 절차는 시간 의존적인 과정인 자가식 및 프로테아솜 기판의 축적을 일으키는 leupeptin 또는 bortezomib의 능력에 달려 있습니다.이 기술은 생물학적 리듬이 간 단백질 이화증을 어떻게 프로그래밍하는지에 대한 탐구를 허용했습니다. 우리는 그것이 세포 가사 기능에 질병의 효력을 조사하기위한 길을 열어 줄 수 있기를 바랍니다.

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