Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
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Este trabalho foi financiado por RO1HL135846 e um Instituto de desenvolvimento infantil Grant (PD-II-2016-529).

O protocolo aqui descrito foi aprovado pela Universidade de Washington em St. Louis animal Care e use Committee (IACUC).
1. mouse habitação e design experimental
<ol><li>Para detectar ritmos diários no retorno da proteína, os ratos da casa (macho ou fêmea C57BL/6J, 4 − 8 semanas velho, 20 − 25 g) a luz padrão de 12 h/ciclos escuros com alimento forneceram ad libitum. Para evitar enfatizar os animais, aclimatar camundongos por pelo menos uma semana na instalação antes de ...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

Nosso protocolo descreve um meio tecnicamente direto de medir ritmos biológicos na rotatividade de proteínas em camundongos usando equipamentos de biologia molecular comumente disponíveis. Por causa da duração dos experimentos em séries temporais e do número de amostras biológicas envolvidas, é importante ser consistente em todo o experimento sobre como os camundongos são injetados, o tempo de aquisição de tecidos e o processamento bioquímico de Amostras. As etapas de injeção, eutanásia e luxação cervic...

Os ritmos circadianos referem-se a variações diárias e previsíveis na função biológica que são aparentes em toda a natureza. Existem em cada escala biológica, a partir de comportamentos macroscópicos como ciclos de vigília-sono, a fenômenos moleculares como a abundância rítmica de biomoléculas. Nos últimos anos, a pesquisa sobre ritmos circadianos tem sido transformada pela descoberta de "genes do relógio" que são críticos para a geração do ritmo circadiano. Os estudos em camundongos knockout do gene do pulso de disparo revelaram um papel central para ritmos circadiano em organizar temporally processos celulares do núcleo tais como o metabolismo1. Entre as maneiras ritmos circadianos fazer isso acontecer é por transmitir uma estrutura temporal para o catabolismo de proteínas.
Vários grupos, incluindo o nosso, mostraram que as duas principais avenidas para o catabolismo de proteínas celulares, a autofagia e o sistema ubiquitina-proteasome, estão sujeitas a ritmos diurnos2,3,4,5. Autophagy representa o braço lysosome-dependente do catabolismo da proteína em que as proteínas do interesse são entregadas a este organela degradative através da construção de um vesícula novo (macroautophagy) ou através do translocação direto embora um canal (Autophagy negociado Chaperone)6. O sistema de ubiquitina-proteasome é a principal via não-lisossomal, onde as proteínas são poli-ubiquitadas e, em seguida, alimentadas no proteasome, uma máquina degradativa macromolecular encontrada em todo o citoplasma e núcleo7,8. Os ritmos na atividade do autofágico e do degradação são importantes porque jogam provavelmente um papel no Housekeeping celular. Em conseqüência, é valioso ter um procedimento padronizado que possa detectar oscilações diárias no catabolismo da proteína que é compatível com modelos pré-clínicos da doença.
Aqui, nós fornecemos nosso protocolo para quantificar variações diurnas no fluxo autofágico no fígado do rato, que serviu como a base para o trabalho em nosso laboratório3,9. Nosso método é classificado como um "ensaio de turnover"10, uma abordagem utilizada por inúmeros grupos para medir a atividade proteolítica (ou fluxo). Nesta abordagem, os inibidores de protease específicos para lisossomos ou proteasomas são administrados em camundongos e, em seguida, amostras de tecido são obtidas após um intervalo de tempo fixo. Em paralelo, amostras de tecido são obtidas de camundongos submetidos a injeções simuladas. As amostras de tecido são homogeneizadas e, em seguida, separadas bioquimicamente para obter as frações lisossome-enriquecidas e citoplasmáticas. Essas frações são então analisadas em paralelo via Western blotting usando anticorpos específicos para marcadores de macroautofagia (LC3b e p62) ou substratos degradação (proteína poli-ubiquitinada). Ao longo do tempo, os animais injetados com inibidores da protease acumulam proteínas que normalmente teriam sido recicladas. Como resultado, a taxa de rotatividade é inferida comparando-se a abundância de proteínas de marcador nas amostras tratadas com inibidor de protease às amostras tratadas com Sham. Ao repetir este método em intervalos de tempo fixos ao longo do dia é possível reconstruir as variações circadianas na proteólise (Figura 1a).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

As células empregam vários métodos para reciclagem de proteínas indesejadas e outros materiais, incluindo vias lisossomais e não-lisossossômicas. A via lisossoma-dependente principal é chamada de autofagia, enquanto o método primário não-lisossomal para o catabolismo protéico é o sistema de oniquitina-proteasome. Estudos recentes em organismos modelo sugerem que a atividade da autofagia e do sistema de ubiquitina-proteasome não é constante ao longo do dia, mas em vez disso, varia de acordo com um ritmo diário (circadiano). A capacidade de medir ritmos biológicos no turnover da proteína é importante para compreender como o controle de qualidade celular é alcançado e para compreender a dinâmica de proteínas específicas de interesse. Aqui nós apresentamos um protocolo estandardizado para quantificar in vivo o fluxo autofágico e degradação que captura o componente circadiano do retorno da proteína. Nosso protocolo inclui detalhes para manipulação do mouse, processamento de tecidos, fraccionamento e quantificação de fluxo autofágico usando o fígado do mouse como o material de partida.

Os dados representativos são apresentados na Figura 2a, B, e a quantificação desses dados é fornecida na Figura 2C, D (vide também arquivo suplementar "dados de amostra"). Para simplificar, não representamos controles de carregamento na Figura 2 , mas estes devem ser obtidos em paralelo. Tipicamente, os borrões ocidentais de encontro ao β-Actin são usados para esta finalida...

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Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Nós descrevemos nosso protocolo para medir ritmos biológicos no catabolismo da proteína através do autofagia e do Proteassoma no fígado do rato.

Medindo ritmos diurnos no fluxo autophagic e Proteasomal

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Nosso protocolo permite a medição da taxa de autofagia e atividade proteasômica nos tecidos do camundongo e é sensível o suficiente para detectar variações circadianas dentro dessas atividades. Esta técnica pode ser usada in vivo para avaliar o catabolismo proteico em células e tecidos e os materiais necessários são relativamente de baixa tecnologia e acessíveis a qualquer laboratório de biologia molecular. Demonstrando o procedimento será Mikhail Ryzhikov, um pós-doutor do meu laboratório.Durante quinze minutos antes de cada ponto de tempo, aqueça as soluções de estoque de leupeptina e bortezomib à temperatura ambiente e dilua o bortezomib descongelado em PBS estéril para produzir uma solução de trabalho de 50 miligramas por mililitro. Para administração inibidora de protease, injete intraperitoneally 40 miligramas por quilograma de leupeptina ou 1,6 microgramas por quilograma de bortezomib em cada animal experimental. Para um controle negativo, injete camundongos com 0,5 mililitros de PBS.Devolva cada rato às gaiolas agrupadas pelo tipo de tratamento recebido à medida que são injetados e regise o tempo em que os ratos são tratados ou manipulados em uma tabela padronizada. Duas horas após a injeção, submergir o lobo hepático esquerdo colhido de cada animal experimental sacrificado em sete mililitros de tampão de homogeneização fria em tubos cônicos apropriadamente rotulados 15 mililitros no gelo. Quando todas as amostras tiverem sido adquiridas, transfira a primeira amostra e todo o volume de tampão de homogeneização para um homogeneizador do Dounce de capacidade de 15 mililitros e homogeneize a amostra com 10 traços do pistão solto e 15 traços do pistão apertado.Retorne o homogeneado bruto resultante ao seu tubo original e homogeneize a próxima amostra como apenas demonstrado. Quando todas as amostras foram homogeneizadas, sedimente os núcleos homogeneizados e detritos por centrifugação e transfira os quatro mililitros de cada supernante pós-nuclear em novos tubos de 15 mililitros. Determine a concentração proteica desta primeira fração sobrenana de acordo com os protocolos padrão e equalize as concentrações de todas as amostras a 2,1 miligramas por mililitro com tampão de homogeneização fresco conforme necessário.Para análise a jusante e melhoria da qualidade, alíquota de 500 microlitadores das frações de proteína total normalizadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Transfira 1,5 mililitros de cada uma das frações de proteína totais restantes em tubos individuais de microcentrifuuuga e pelota as amostras de proteína por centrifugação. Transfira um mililitro da segunda fração resultante para novos tubos de microcentrifuuagem no gelo e aspire os supernantes restantes.Lave as pelotas 3K duas vezes em 1,5 mililitros de tampão de homogeneização a frio fresco por lavagem, depois resuspenque a pelota 3K em 200 microliters de tampão de amostra SDS-PAGE e ferva as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Gire a segunda fração de supernantes por 20 minutos a 20.000 x g e quatro graus Celsius e transfira os supernantes de fração citoplasmática resultantes para um novo tubo de microcentrifuuagem. Para análise SDS-PAGE, combine 150 microliters da fração citoplasmática com 50 microliters de tampão de amostra 4x SDS-PAGE e ferva as amostras de fração citoplasmática a 95 graus Celsius por cinco minutos.Aspire o restante do supernascedor das pelotas de 20K e lave as amostras duas vezes com 1,5 mililitros de tampão de homogeneização a frio fresco por lavagem. Em seguida, resuspenque a pelota de 20K em 100 microliters de tampão de amostra SDS-PAGE para ferver a 95 graus Celsius por cinco minutos. Para análise de manchas ocidentais, diluem em série proteínas de curva padrão de um a três em 1x tampão de amostra para um total de seis diluições e carregue 10 microliters de cada amostra de curva padrão em um poço de um gel midi de 26 poços de 4 a 12% SDS-PAGE, em seguida, carregue um padrão de peso molecular comercial prestained.Para medir o fluxo autofágico, carregue 12 microlitadores de cada amostra de pelotas 3K nos poços apropriados. Para medir o fluxo proteassômico, carregue 12 microlitres de cada fração citoplasmática nos poços apropriados. Quando todas as amostras de controle e experimentais tiverem sido carregadas, separe as amostras de proteínas por SDS-PAGE antes de transferir as proteínas para membranas de flúor de polivinida de acordo com os protocolos padrão.Para analisar o fluxo macroautofágico, as membranas manchadas contendo as amostras de pelotas 3K com anticorpo anti-p62 ou anti-LcB durante a noite a quatro graus Celsius. Para analisar o fluxo proteassômico, as membranas manchadas contendo as amostras de fração citoplasmática com anticorpo anti-ubiquitina 48-Específico da poli ubiquitina durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, imagem as manchas ocidentais usando anticorpos secundários padrão e dispositivos de imagem.Para realizar medições densitométricas em bandas de interesse tanto para a curva padrão quanto para amostras experimentais, abra um programa de software de análise de imagem apropriado e desenhe um longo retângulo que abrange o monômero proteico de interesse na parte inferior da imagem da mancha que se estende até o topo da membrana. Copie e cole para mover o retângulo para as amostras restantes, mantendo o retângulo consistente entre as amostras. Salve a quantificação em uma planilha e gere uma curva padrão densitométrica dentro da planilha usando a amostra padrão diluída serialmente em regressão linear ou polinomial para obter uma equação de curva padrão mais adequada.Usando esta equação, extrapolie a quantidade dos monômeros de interesse dentro das amostras experimentais. Para obter medições de fluxo, subtraia a quantidade de proteína extrapolada de cada amostra tratada inibidora a partir do valor médio das amostras de PBS a partir do mesmo ponto de tempo. Em seguida, avalie a significância estatística da variação temporal no volume de negócios proteicos utilizando ANOVA unidirecional.A leitura primária para o fluxo autofágico a qualquer ponto de tempo é a diferença na quantidade de marcadores específicos da macroautofagia entre a leupeptina tratada versus as amostras falsas na fração de pelota 3K enriquecida com lisósomo dividida por dois. Normalmente, os resultados são normalizados para a média que simplifica a comparação entre experimentos independentes. Nosso procedimento para medir o fluxo proteolítico depende da capacidade da leupeptina ou bortezomib de causar o acúmulo de substratos de autofagia e proteasome, que é um processo dependente do tempo.Esta técnica permitiu a exploração de como ritmos biológicos programam catabolismo de proteína hepática. Esperamos que abra caminho para investigar os efeitos da doença nas funções de limpeza celular.

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