Name: measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00
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Este trabajo fue financiado por RO1HL135846 y una beca del Instituto de Desarrollo Infantil (PD-II-2016-529).

El protocolo descrito aquí fue aprobado por la Universidad de Washington en st. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Carcasa de ratón y diseño experimental
<ol><li>Para detectar ritmos diarios en la rotación de proteínas, ratones domésticos (masculino o femenino C57BL/6J, de 4 a 8 semanas de edad, 20 a 25 g) bajo ciclos estándar de 12 h de luz/oscuridad con alimentos proporcionados ad libitum. Para evitar estresar a los animales, aclimate ratones durante al menos u...

<ol>
	<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages.">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li><li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy.">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li><li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy.">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li><li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts.">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+protein+degradation:+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting.">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li><li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Logic+of+the+26S+Proteasome.">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li><li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay.">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li><li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice.">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li><li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms.">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li></ol>

Nuestro protocolo describe un medio técnicamente sencillo de medir los ritmos biológicos en la rotación de proteínas en ratones utilizando equipos de biología molecular comúnmente disponibles. Debido a la duración de los experimentos de series temporales y el número de muestras biológicas involucradas, es importante ser consistente en todo el experimento con respecto a cómo se inyectan los ratones, el momento de la adquisición de tejidos y el procesamiento bioquímico de Muestras. Las etapas de inyección, eut...

Los ritmos circadianos se refieren a variaciones diarias y predecibles en la función biológica que son evidentes en toda la naturaleza. Existen a todas las escalas biológicas, desde comportamientos macroscópicos como ciclos sueño-vigilia, hasta fenómenos moleculares como la abundancia rítmica de biomoléculas. En los últimos años, la investigación sobre los ritmos circadianos se ha transformado por el descubrimiento de "genes de reloj" que son críticos para la generación del ritmo circadiano. Los estudios en ratones knockout del gen del reloj han revelado un papel central para los ritmos circadianos en la organización temporal de los procesos celulares centrales como el metabolismo1. Entre las formas en que los ritmos circadianos hacen que esto suceda es impartir una estructura temporal al catabolismo proteico.
Varios grupos incluyendo el nuestro han demostrado que las dos principales vías para el catabolismo proteico celular, la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma, están sujetas a ritmos diurnos2,3,4,5. La autofagia representa el brazo lisososodependiente del catabolismo proteico en el que las proteínas de interés se entregan a este orgánulo degradante ya sea a través de la construcción de una vesícula novedosa (macroautofagia) o a través de una translocación directa a través de una canal (autofagia mediada por chaperón)6. El sistema ubiquitina-proteasoma es la principal vía no lisosomal, donde las proteínas son poliubiquitinadas y luego se alimentan en el proteosoma, una máquina degradante macromolecular que se encuentra en todo el citoplasma y el núcleo7,8. Los ritmos en la actividad autofágica y proteasomal son importantes porque probablemente juegan un papel en la limpieza celular. Como resultado, es valioso tener un procedimiento estandarizado que pueda detectar oscilaciones diarias en el catabolismo proteico que es compatible con modelos de enfermedad preclínica.
Aquí, proporcionamos nuestro protocolo para cuantificar las variaciones diurnas en el flujo autofágico en el hígado de ratón, que ha servido de base para el trabajo en nuestro laboratorio3,9. Nuestro método se clasifica como un "ensayo de volumen de negocios"10,un enfoque utilizado por numerosos grupos para medir la actividad proteolítica (o flujo). En este enfoque, los inhibidores de la proteasa específicos de los lisosomas o proteasomas se administran a ratones y luego se obtienen muestras de tejido después de un intervalo de tiempo fijo. Paralelamente, las muestras de tejido se obtienen de ratones sometidos a inyecciones falsas. Las muestras de tejido se homogeneizan y luego se separan bioquímicamente para obtener las fracciones lisosomas y citoplasmáticas. Estas fracciones se analizan en paralelo a través de la hincha occidental utilizando anticuerpos específicos de los marcadores de macroautofagia (LC3b y p62) o sustratos proteasomales (proteína poliubiquitinada). Con el tiempo, los animales inyectados con inhibidores de la proteasa acumulan proteínas que normalmente se habrían reciclado. Como resultado, la tasa de rotación se deduce comparando la abundancia de proteínas marcadoras en las muestras tratadas con inhibidores de la proteasa con las muestras tratadas con farsa. Al repetir este método a intervalos de tiempo fijos a lo largo del día es posible reconstruir variaciones circadianas en la proteólisis(Figura 1A).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bortezomib</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td>Cat# IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3a</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UL-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC3b antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# WG1403BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P62-his</td>
			<td>Novus</td>
			<td>Cat# NBP1-44490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Cat# 1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>Cat# UC-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat# WG1403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Cat# S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring diurnal rhythms in autophagic and proteasomal flux

Las células emplean varios métodos para reciclar proteínas no deseadas y otros materiales, incluyendo vías lisosomal y no lisosomal. La vía principal dependiente del lisosoma se llama autofagia, mientras que el método principal no lisosomal para el catabolismo proteico es el sistema ubiquitina-proteosoma. Estudios recientes en organismos modelo sugieren que la actividad de la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma no es constante a lo largo del día, sino que varía según un ritmo diario (circadiano). La capacidad de medir los ritmos biológicos en la rotación de proteínas es importante para entender cómo se logra el control de calidad celular y para entender la dinámica de proteínas específicas de interés. Aquí presentamos un protocolo estandarizado para cuantificar el flujo autofágico y proteasomal in vivo que captura el componente circadiano de la rotación de proteínas. Nuestro protocolo incluye detalles para el manejo del ratón, procesamiento de tejidos, fraccionamiento y cuantificación de flujo autofágico utilizando el hígado del ratón como material de partida.

Los datos representativos se presentan en la Figura 2A,B, y la cuantificación de estos datos se proporciona en la Figura 2C,D (véase también Archivo Suplementario "Datosde muestra" ). Para simplificar, no hemos representado los controles de carga en la Figura 2, pero estos deben obtenerse en paralelo. Típicamente, las manchas occidentales contra la actina se utilizan para este p...

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Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Describimos nuestro protocolo para medir los ritmos biológicos en el catabolismo proteico a través de la autofagia y el proteosoma en el hígado de ratón.

Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Nuestro protocolo permite medir la velocidad de autofagia y actividad proteasomal en los tejidos del ratón y es lo suficientemente sensible como para detectar variaciones circadianas dentro de estas actividades. Esta técnica se puede utilizar in vivo para evaluar el catabolismo proteico en células y tejidos y los materiales requeridos son relativamente de baja tecnología y accesibles a cualquier laboratorio de biología molecular. Demostrando el procedimiento estará Mikhail Ryzhikov, un post-doc de mi laboratorio.Durante quince minutos antes de cada punto de tiempo, caliente las soluciones de stock de leupeptina y bortezomib a temperatura ambiente y diluya el bortezomib descongelado en PBS estéril para producir una solución de trabajo de 50 miligramos por mililitro. Para la administración de inhibidores de la proteasa, inyectar por vía intraperitoneal 40 miligramos por kilogramo de leupeptina o 1,6 microgramos por kilogramo de bortezomib en cada animal experimental. Para un control negativo, inyecte ratones con 0,5 mililitros de PBS.Devolver cada ratón a las jaulas agrupadas por el tipo de tratamiento recibido a medida que se inyectan y registrar el tiempo que los ratones son tratados o manipulados en una tabla estandarizada. Dos horas después de la inyección, sumerja el lóbulo hepático izquierdo cosechado de cada animal experimental sacrificado en siete mililitros de tampón de homogeneización con frío en tubos cónicos de 15 mililitros debidamente etiquetados sobre hielo. Una vez adquiridas todas las muestras, transfiera la primera muestra y todo el volumen del tampón de homogeneización a un homogeneizador Dounce de 15 mililitros de capacidad y homogeneice la muestra con 10 golpes del pistón suelto y 15 golpes del pistón apretado.Devuelva el crudo resultante a su tubo original y homogeneice la siguiente muestra como se acaba de demostrar. Cuando todas las muestras han sido homogeneizadas, sedimentar los núcleos homogeneizados y escombros por centrifugación y transferir los cuatro mililitros superiores de cada sobrenadante post-nuclear en nuevos tubos de 15 mililitros. Determinar la concentración proteica de esta primera fracción sobrenadante de acuerdo con los protocolos estándar e igualar las concentraciones de todas las muestras a 2,1 miligramos por mililitro con tampón de homogeneización fresca según sea necesario.Para el análisis posterior y la mejora de la calidad, aliquot 500 microlitros de las fracciones totales de proteínas normalizadas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Transfiera 1,5 mililitros de cada una de las fracciones totales de proteínas restantes a tubos de microcentrífuga individuales y pelete las muestras de proteínas por centrifugación. Transfiera un mililitro de los sobrenadantes de segunda fracción resultantes a nuevos tubos de microcentrífuga sobre hielo y aspire los sobrenadantes restantes.Lave los pellets 3K dos veces en 1,5 mililitros de tampón de homogeneización en frío fresco por lavado, luego resuspender el pellet 3K en 200 microlitros de tampón de muestra SDS-PAGE y hervir las muestras a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Gire los sobrenadantes de segunda fracción durante 20 minutos a 20.000 x g y cuatro grados Celsius y transfiera los sobrenadantes de fracción citoplasmático resultantes a un nuevo tubo de microcentrífuga. Para el análisis SDS-PAGE, combine 150 microlitros de la fracción citoplasmático con 50 microlitros de tampón de muestra 4x SDS-PAGE y hierva las muestras de fracción citoplasmático a 95 grados Celsius durante cinco minutos.Aspirar el sobrenadante restante de los pellets de 20K y lavar las muestras dos veces con 1,5 mililitros de tampón de homogeneización fría fresca por lavado. A continuación, resuspender el pellet 20K en 100 microlitros de tampón de muestra SDS-PAGE para hervir a 95 grados Cent durante cinco minutos. Para el análisis de manchas occidentales, diluir en serie las proteínas de curva estándar de uno a tres en 1x tampón de muestra para un total de seis diluciones y cargar 10 microlitros de cada muestra de curva estándar en un pozo de 26 pozos de cuatro a 12%SDS-PAGE midi gel, a continuación, cargar un estándar de peso molecular comercial prestenido.Para medir el flujo autofágico, cargue 12 microlitros de cada muestra de pellet 3K en los pozos apropiados. Para medir el flujo proteasomal, cargue 12 microlitros de cada fracción citoplasmático en los pozos apropiados. Una vez cargadas todas las muestras de control y experimentales, separe las muestras de proteínas por SDS-PAGE antes de transferir las proteínas a membranas de fluoruro de polivinilideno de acuerdo con los protocolos estándar.Para analizar el flujo macroautofágico, membranas manchadas que contienen las muestras de pellets 3K con anticuerpos anti-p62 o anti-LcB durante la noche a cuatro grados Celsius. Para analizar el flujo proteasomal, membranas manchadas que contienen las muestras de fracción citoplasmática con anticuerpos de poliubiquitina anti lisina 48-Específicos durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, imagine las manchas occidentales utilizando anticuerpos secundarios estándar y dispositivos de imágenes.Para realizar mediciones densitométricas en bandas de interés tanto para la curva estándar como para las muestras experimentales, abra un programa de software de análisis de imágenes adecuado y dibuje un rectángulo largo que abarque el monómero de proteínas de interés en la parte inferior de la imagen de la mancha que se extiende hasta la parte superior de la membrana. Copie y pegue para mover el rectángulo a las muestras restantes, manteniendo el rectángulo coherente entre las muestras. Guarde la cuantificación en una hoja de cálculo y genere una curva estándar densitométrica dentro de la hoja de cálculo utilizando la muestra estándar diluida en serie en regresión lineal o polinómica para obtener una ecuación de curva estándar de mejor ajuste.Usando esta ecuación, extrapolar la cantidad de los monómeros de interés dentro de las muestras experimentales. Para obtener mediciones de flujo, reste la cantidad de proteína extrapolada de cada muestra tratada con inhibidor del valor medio de las muestras de PBS del mismo punto de tiempo. A continuación, evalúe la significancia estadística de la variación temporal en la rotación de proteínas utilizando ANOVA unidireccional.La lectura primaria para el flujo autofágico en cualquier punto de tiempo dado es la diferencia en la cantidad de marcadores específicos de macroautofagia entre la leupeptina tratada frente a las muestras falsas en la fracción de pellet 3K enriquecida con lisosoma dividida por dos. Normalmente, los resultados se normalizan a la media que simplifica la comparación entre experimentos independientes. Nuestro procedimiento para medir el flujo proteolítico depende de la capacidad de la leupeptina o bortezomib para causar la acumulación de sustratos de autofagia y proteasoma, que es un proceso dependiente del tiempo.Esta técnica ha permitido explorar cómo los ritmos biológicos programan el catabolismo de proteínas hepáticas. Esperamos que allane el camino para investigar los efectos de la enfermedad en las funciones de limpieza celular.

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