Name: immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
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Ringraziamo i laboratori, gli epidemiologi e gli affiliati con i dipartimenti di sanità pubblica per la presentazione di campioni ai Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie. I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dei Centers for Disease Control and Prevention. L'uso di nomi commerciali e fonti commerciali è solo per l'identificazione e non implica l'approvazione da parte dei Centers for Disease Control and Prevention.

Mentre il protocollo IHC è stato eseguito su tessuti fissati alla formalina, che inattiva RABV se presente, devono essere seguiti correttamente protocolli di biosicurezza appropriati. Tutte le procedure di biosicurezza sono descritte nella Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluso l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) e l'obbligo di vaccinazione come descritto12. Inoltre...

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies+prevention--United+States,+2008:+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices.">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).</li><li>Patrick, E. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens.">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).</li><li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. 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A causa dell'elevato tasso di mortalità della rabbia dopo l'insorgenza dei sintomi, la diagnosi di animali sospetti per l'infezione da RABV è estremamente critica per un appropriato trattamento profilattico post-esposizione. La diagnosi di rabbia dipende principalmente da tecniche basate su DFA, DRIT e PCR che utilizzano tessuti freschi o congelati. Per il test di tessuti fissati alla formalina, il test IHC fornisce un metodo alternativo per il rilevamento sensibile e specifico dell'antigene RABV. Mentre i tessuti fiss...

La rabbia è un'encefalite progressiva acuta causata dai virus a RNA a senso negativo appartenenti al genere lyssavirus1. Quasi il 99% di tutti i decessi umani causati dall'infezione da virus della rabbia (RABV), il tipo di membro del genere, è trasmesso dai cani2. La diagnosi di rabbia di animali sospetti si basa sulla rilevazione di antigene (principalmente nucleoproteina codificata virale, proteina N) in complesso con RNA genomico (complesso ribonucleoproteico, RNP) nel tessuto cerebrale3. Il rilevamento dell'antigene mediante il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) è considerato il gold standard per la diagnosi dirabbia 4. Il metodo utilizza materiale cerebrale congelato fresco o fresco, un'impronta tattile su un vetrino, fissazione in acetone, colorazione utilizzando anticorpi fluorescenti isotiocianati (FITC) etichettati come monoclonali o policlonali (mAbs / pAbs) e letti dalla microscopia a fluorescenza5. Il test DFA è rapido, sensibile e specifico per il rilevamento dell'antigene della rabbia nel tessuto cerebrale fresco. Recentemente, un test immunoistochimico rapido diretto (DRIT), tecnica di immunoistochimica modificata (IHC), ha dimostrato di mostrare una sensibilità simile al DFA ma offre il vantaggio della microscopia ottica per lavisualizzazione 6. Mentre il metodo di rilevamento utilizzato in DRIT è simile a IHC, la fase iniziale utilizza tessuti freschi o congelati per generare impressioni tattili del campione seguite dalla fissazione in formalina.
L'IHC è una tecnica ampiamente utilizzata per determinare i cambiamenti istologici e il rilevamento di proteine utilizzando anticorpi specifici in tessuti fissati con formalina incorporati in blocchi di paraffina. IHC è un test alternativo consolidato per il rilevamento dell'antigene della rabbia nelle sezioni tissutali7. IHC è stato particolarmente utilizzato per la diagnosi di casi retrospettivi che hanno mostrato malattie neurologiche per determinare il carico dellarabbia 8. I tessuti fissati in formalina incorporati nella paraffina preservano le proteine per il rilevamento anche dopo diversi anni se conservati a temperatura ambiente9. Il trattamento con formalina modifica le proteine attraversando e alterando le catene laterali degli aminoacidi, il che potrebbe rendere gli epitopi non più reattivi contro gli anticorpi10. Mentre il test IHC per il rilevamento dell'antigene della rabbia coinvolge mAbs o pAbs, quest'ultimo è vantaggioso in quanto possono essere rilevati più epitopi e lyssavirus divergenti11.
Le fasi standard coinvolte nell'IHC sono la fissazione della formalina dei tessuti, l'incorporamento in blocchi di paraffina, il sezionamento dei tessuti, la deparaffinizzazione e l'idratazione, il recupero dell'epitopo, la reattività contro gli anticorpi primari e secondari e lo sviluppo utilizzando substrati cromogenici. Questo manoscritto descrive un resoconto dettagliato del protocollo per la diagnosi della rabbia. Per il rilevamento dell'antigene della rabbia, viene utilizzato il siero di topo immunizzato con RABV (pAbs) generato presso i Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) di Atlanta, in Georgia, in combinazione con anticorpi secondari anti-topo biotinilati. Gli addominali biotinilati sono rilevati dall'aggiunta del complesso streptaviduina-rafano perossidasi (HRP) seguito dallo sviluppo del colore con substrato amino-etilcarbazolo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Pharamacy brands</td>
			<td></td>
			<td>Off the shelf 3% H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer pH 5.2</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips Corning</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-471</td>
			<td>24 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s hematoxylin formulation #2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td>
			<td>seracare</td>
			<td>71-00-18</td>
			<td>Mouse Primary Antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoHistoMount</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>i1161</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N, Dimethyl formamide GR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>RR14440.01</td>
			<td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>53702</td>
			<td>Protease, Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s Tap Water&#160;</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide stain set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-80&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>Histological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues

Una delle principali modalità diagnostiche per la rabbia è il rilevamento del complesso virale ribonucleoproteina (antigene) (antigene) nei campioni di tessuto infetto. Mentre il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) o il test immunoistochimico rapido diretto (DRIT) sono più comunemente utilizzati per il rilevamento dell'antigene, entrambi i test richiedono tessuti freschi e / o congelati per le impronte sui vetrini prima del rilevamento dell'antigene utilizzando anticorpi. Se i campioni vengono raccolti e fissati in formalina, nessuno dei due test è ottimale per il rilevamento dell'antigene, tuttavia, il test può essere eseguito mediante immunoistochimica convenzionale (IHC) dopo l'incorporamento in blocchi di paraffina e sezionamento. Con questo metodo IHC, i tessuti vengono colorati con anticorpi antirabbici, le sezioni vengono deparaffinizzate, l'antigene recuperato mediante proteolisi parziale o altri metodi e incubato con anticorpi primari e secondari. Gli antigeni vengono colorati utilizzando perossidasi di rafano / amminoetilcarazolo e contromacchiati con ematossilina per la visualizzazione utilizzando un microscopio ottico. Oltre al rilevamento specifico dell'antigene, la fissazione della formalina offre altri vantaggi come la determinazione dei cambiamenti istologici, condizioni rilassate per la conservazione e il trasporto dei campioni (a temperatura ambiente), capacità di testare casi retrospettivi e una maggiore sicurezza biologica attraverso l'inattivazione di agenti infettivi.

La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi della colorazione IHC di campioni di controllo positivi e negativi in diversi tessuti cerebrali testati. La Figura 2A,D,G rappresenta campioni positivi a 200x, mentre la Figura 2B,E,H corrisponde rispettivamente all'ingrandimento 400x. Figura 2A-C corrisponde al tronco cereb...

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Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Qui, presentiamo un protocollo di test immunoistochimico per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina.

Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

I tessuti utilizzati per l'immunoistochimica e per l'istopatologia diagnostica sono regolarmente fissati in formalina tampone fosfato al 10%. Il rilevamento dell'antigene del virus della rabbia nel tessuto cerebrale che è stato fissato nella formalina presenta una sfida unica e il test IHC è stato trovato un metodo sensibile e specifico per il rilevamento dell'antigene del virus della rabbia. Il vantaggio principale della biopsia o di altri metodi di rilevamento è che gli antigeni possono essere rilevati in relazione alla morfologia tissutale e cellulare.Con IHC, la localizzazione dell'antigene della rabbia nel cervello e nei tessuti non cerebrali, fornisce ulteriori informazioni che non possono essere ottenute attraverso le sezioni di routine di Ematoxylin e Eosin. Il test diagnostico della rabbia è importante per l'inizio della profilassi post-esposizione negli esseri umani esposti al virus della rabbia. IHC è uno dei saggi più comunemente eseguiti su tessuti fissati alla formalina.Con anticorpi specifici, può essere utilizzato per il rilevamento dei rispettivi agenti patogeni. Per iniziare questa procedura, posizionare da tre a cinque pezzi millimetrici di tessuto cerebrale, raccolti dopo l'autopsia, in una soluzione di formalina tamponata al 10% per 24-72 ore. Registrare il peso approssimativo del tessuto, il tipo di tessuto e il volume di formalina.Posizionare i tessuti in etanolo al 70% per una conservazione più lunga del tessuto dopo la fissazione della formalina e prima della lavorazione. Dopo la fissazione del campione, sezionare il tessuto per includere le aree cerebrali importanti, come le sezioni trasversali del tronco cerebrale, il cervelletto o l'ippocampo. Ciascuno, tagliato ad uno spessore compreso tra tre e cinque millimetri.Posizionare i tessuti in cassette di elaborazione. Elaborare le cassette di tessuto per l'infiltrazione di cera di paraffina. Incorporali in blocchi di paraffina e sezionali su un microtomo.Impostare innanzitutto la parabola di colorazione come indicato nella Figura 1 del protocollo di testo. Riempire ogni piatto con 250 millilitri della soluzione preparata. Per preparare la soluzione madre del substrato AEC, utilizzare una pipetta di vetro per sciogliere una compressa da 20 milligrammi di AEC in 5 millilitri di N, N-dimetilformammide.Per preparare la soluzione madre di proteasi, sciogliere 7 milligrammi di proteasi in 200 millilitri di PBS. Per preparare il tampone di risciacquo, aggiungere 100 millilitri di Tween da 80 a 990 millilitri di PBS e mescolare bene per formare una soluzione omogenea di PBT-T. Usando un microtomo, crea una sezione di paraffina di cinque micrometri.Caricare la sezione a bagnomaria a 38 gradi Celsius e raccoglierla su vetrini. Etichettare i vetrini con una penna resistente ai reagenti. Posizionare i vetrini su un vassoio e sciogliere in forno a 55-60 gradi Celsius per un'ora.Quindi, rimuovere i vetrini dal forno e deparaffinarli immediatamente, utilizzando 3 risciacqui consecutivi di xilene di 5 minuti ciascuno. Successivamente, reidratare le sezioni sulla diapositiva mediante immersioni sequenziali in diluizioni decrescenti di etanolo in acqua deionizzata, come delineato nel protocollo di testo. Trattare i vetrini con la proteasi per 30 minuti per il recupero dell'antigene proteolitico, quindi risciacquare i vetrini in PBS-T per 10 minuti e trattarli con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti.Successivamente, lavare nuovamente le diapositive con PBS-T per 10 minuti. Per iniziare, rimuovere una diapositiva dal buffer, assicurandosi di maneggiare solo una diapositiva alla volta, mentre le altre rimangono sommerse, e utilizzare un tovagliolo di carta per eliminare il tampone in eccesso da tutta la sezione del tessuto. Posizionare i vetrini in una camera di umidità e incubare con normale siero di capra a temperatura ambiente per 15 minuti.Quindi, incubare i vetrini nella camera di umidità con l'anticorpo antirabbico primario di diluizione predeterminato ottimale e gli anticorpi di controllo negativi, a temperatura ambiente per 60 minuti senza lavaggi intermedi. Successivamente, lavare i vetrini con PBS-T per 10 minuti e incubare in una camera di umidità con l'anticorpo biotinilato a temperatura ambiente per 15 minuti. Lavare nuovamente le diapositive con PBS-T per 10 minuti.Incubare i vetrini e la camera di umidità con strip divide e complesso HRB a temperatura ambiente per 15 minuti e lavare il PBS-T per 10 minuti. Quindi, incubare con AEC in una camera di umidità a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare gli scivoli in acqua deionizzata per 10 minuti e controbattere con Gill's Hematoxilyn, diluito uno o due con acqua deionizzata per due minuti.Successivamente, risciacquare l'ematossilina in eccesso immergendo i vetrini in acqua deionizzata. Risciacquare i vetrini in Scott's Tap Water per 30 secondi e lavare in acqua deionizzata per 10 minuti. Rimuovere le diapositive una alla volta e montarle con un mezzo di montaggio solubile in acqua.Quindi, utilizzare un microscopio ottico per leggere le diapositive. In questo studio, viene dimostrato un test di chimica immunocitica per il rilevamento dell'antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina. Qui viene mostrato un risultato rappresentativo della colorazione chimica immunocitica di campioni di controllo positivi e negativi in diversi tessuti cerebrali, tra cui il tronco cerebrale, il cervelletto e le cellule di purkinje e l'ippocampo.La colorazione rosso magenta, che indica lo sviluppo del colore utilizzando il substrato AEC sullo sfondo blu controcolorato, è dovuta alla reattività degli anticorpi contro l'antigene della rabbia. Un risultato positivo in immunoistochimica corrisponde alla colorazione rosso magenta nelle sezioni tissutali. La colorazione di inclusioni citoplasmatiche e inclusioni granulari di varie dimensioni sono indicative di campioni positivi per infezioni da RABV.I campioni sono considerati negativi se non è stata osservata alcuna colorazione rossa specifica o solo lo sfondo blu, a causa dell'ematossilina. Oltre alla colorazione positiva, la distribuzione delle inclusioni potrebbe fornire una quantificazione indiretta dei livelli di antigene della rabbia nel campione, che potrebbe corrispondere alla carica virale del campione di tessuto. Indipendentemente dai livelli di distribuzione, qualsiasi colorazione specifica classificherà il campione come positivo per il rilevamento dell'antigene RABV.I tessuti devono essere fissati adeguatamente in formalina ed evitare di congelare i tessuti durante questo processo. L'antigene della rabbia viene rilevato dall'IHC, quindi le tecniche molecolari possono essere eseguite su sezioni di paraffina per determinare la variante del Lyssavirus in base alle informazioni sulla sequenza dell'RNA. Reagenti come xilene e formalina devono essere maneggiati in cappe aspiranti.Prestare attenzione durante la manipolazione dell'AEC in quanto è cancerogeno.

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