Name: immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues at JoVE.com

Vi takker arbeiderne, epidemiologene og tilknyttede selskaper i folkehelseavdelingene for eksempelinnsendinger til Centers for Disease Control and Prevention. Funnene og konklusjonene i denne rapporten er forfatternes og representerer ikke nødvendigvis den offisielle stillingen til Centers for Disease Control and Prevention. Bruk av varenavn og kommersielle kilder er kun til identifikasjon og innebærer ikke godkjenning fra Centers for Disease Control and Prevention.

Mens IHC-protokollen ble utført på formalin-fast vev, som inaktiverer RABV hvis den finnes, bør passende biosikkerhetsprotokoller følges riktig. Alle biosikkerhetsprosedyrer er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), inkludert bruk av riktig personlig verneutstyr (PVU), og vaksinasjonskrav som beskrevet12. I tillegg bør riktig inneslutning og håndtering av farlige kjemikalier (som fo...

<ol>
	<li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyssaviruses+and+rabies:+current+conundrums,+concerns,+contradictions+and+controversies.">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184 (2017).</li><li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination.">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li><li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus:+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles.">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Expert+Consulation+on+Rabies,+Third+Report.">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).</li><li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens.">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li><li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+direct,+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis.">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li><li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li><li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+five+year+(1985-1989)+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies.">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li><li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues.">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li><li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals.">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li><li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections.">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li><li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+rabies+prevention--United+States,+2008:+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices.">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).</li><li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test.">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li><li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens.">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).</li><li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses.">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li></ol>

På grunn av den høye dødelighetsraten for rabies etter symptomstart, er diagnosen mistenkte dyr for RABV-infeksjon ekstremt kritisk for en passende profylaktisk behandling etter eksponering. Rabiesdiagnosen avhenger hovedsakelig av DFA-, DRIT- og PCR-baserte teknikker ved hjelp av ferskt eller frossent vev. For testing av formalinfast vev gir IHC-testen en alternativ metode for sensitiv og spesifikk påvisning av RABV-antigen. Mens vevet som er festet i formalin har proteiner stabilisert på grunn av modifikasjon av s...

Rabies er en akutt progressiv encefalitt forårsaket av den negative sansen RNA-virus som tilhører slekten lyssavirus1. Nesten 99% av alle menneskelige dødsfall forårsaket av infeksjonen med rabiesvirus (RABV), typemedlemmet av slekten, overføres av hunder2. Rabies diagnose av mistenkte dyr er avhengig av påvisning av antigen (primært viral kodet nukleoprotein, N protein) i kompleks med genomisk RNA (ribonucleoprotein kompleks, RNP) i hjernevevet3. Antigendeteksjonen av den direkte fluorescerende antistoff (DFA) testen regnes som gullstandarden for rabiesdiagnose4. Metoden benytter ferskt eller ferskt frossent hjernemateriale, et berøringsinntrykk på et lysbilde, fiksering i aceton, farging ved hjelp av kommersielt tilgjengelig fluorescerende isothiocyanat (FITC) merket monoklonale eller polyklonale antistoffer (mAbs / pAbs) og lest av fluorescensmikroskopi5. DFA-testen er rask, følsom og spesifikk for rabies antigendeteksjon i ferskt hjernevev. Nylig ble en direkte rask immunhiistokjemisk test (DRIT), modifisert immunhiistokjemi (IHC) teknikk, demonstrert for å vise lignende følsomhet for DFA, men gir fordelen av lysmikroskopi for visualisering6. Mens deteksjonsmetoden som brukes i DRIT, ligner på IHC, bruker det første trinnet friske eller frosne vev for å generere berøringsinntrykk av prøven etterfulgt av fiksering i formalin.
IHC er en mye brukt teknikk for å bestemme histologiske endringer og påvisning av proteiner ved hjelp av spesifikke antistoffer i formalinfast vev innebygd i parafinblokker. IHC er en etablert alternativ test for rabies antigen deteksjon i vevsseksjonene7. IHC har blitt spesielt brukt til diagnostisering av retrospektive tilfeller som utviste nevrologiske sykdommer for å bestemme byrden av rabies8. Paraffin-innebygd formalin-fast vev bevarer proteinene for deteksjon selv etter flere år når de lagres ved omgivelsestemperatur9. Formalin behandling endrer proteiner ved krysskobling og endring av aminosyre sidekjeder, noe som kan gjøre epitopene ikke lenger reaktive mot antistoffer10. Mens IHC-testen for rabies antigendeteksjon innebærer enten mAbs eller pAbs, er sistnevnte fordelaktig da flere epitoper og divergerende lyssavirus kan oppdages11.
Standardtrinnene som er involvert i IHC er formalinfiksering av vev, innebygging i parafinblokker, seksjonering av vev, deparaffinisering og hydrering, epitopgjenoppretting, reaktivitet mot primære og sekundære antistoffer, og utviklingen ved hjelp av kromogene substrater. Dette manuskriptet beskriver en detaljert redegjørelse for protokollen for rabiesdiagnose. For rabies antigen deteksjon, mus serum immunisert med RABV (pAbs) generert på U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, i kombinasjon med biotinylerte antimus sekundære antistoffer brukes. Biotinylerte abs oppdages ved tilsetning av streptavidin-pepperrot peroksidase (HRP) kompleks etterfulgt av fargeutvikling med amino-etylcarbazol substrat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Pharamacy brands</td>
			<td></td>
			<td>Off the shelf 3% H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A6926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate Buffer pH 5.2</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>Certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips Corning</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-471</td>
			<td>24 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s hematoxylin formulation #2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td>
			<td>seracare</td>
			<td>71-00-18</td>
			<td>Mouse Primary Antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoHistoMount</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>i1161</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N, Dimethyl formamide GR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>RR14440.01</td>
			<td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>53702</td>
			<td>Protease, Streptomyces griseus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s Tap Water&#160;</td>
			<td>Poly Scientific R&#38;D Corp.</td>
			<td>s1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Slide stain set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN-80&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3S-4</td>
			<td>Histological Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope</td>
			<td>Multiple vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry test for the lyssavirus antigen detection from formalin-fixed tissues

En av de primære diagnostiske modaliteter for rabies er påvisning av viral ribonucleoprotein (RNP) kompleks (antigen) i de infiserte vevsprøvene. Mens den direkte fluorescerende antistoff (DFA) testen eller den direkte raske immunhiistokjemiske testen (DRIT) oftest brukes til antigendeteksjon, krever begge testene friskt og / eller frossent vev for inntrykk på lysbilder før antigendeteksjonen ved hjelp av antistoffer. Hvis prøver samles inn og festes i formalin, er ingen av testene optimale for antigendeteksjon, men testing kan utføres ved konvensjonell immunhiistokjemi (IHC) etter innebygging i parafinblokker og seksjonering. Med denne IHC-metoden er vev farget med anti-rabies antistoffer, seksjoner deparaffiniseres, antigen hentes ved delvis avhandling eller andre metoder, og inkuberes med primære og sekundære antistoffer. Antigener er farget ved hjelp av pepperrotperoksidase / amino etylkarbazol og motstained med hematoksylin for visualisering ved hjelp av et lett mikroskop. I tillegg til den spesifikke antigendeteksjonen, tilbyr formalinfiksering andre fordeler som bestemmelse av histologiske endringer, avslappede forhold for prøvelagring og transport (under omgivelsestemperaturer), evne til å teste retrospektive tilfeller og forbedret biologisk sikkerhet gjennom inaktivering av smittsomme midler.

Figur 2 viser representative IHC-fargeresultater av positive og negative kontrollprøver i ulike hjernevev som er testet. Figur 2A,D,G representerer positive utvalg ved 200x, mens figur 2B,E,H tilsvarer henholdsvis 400x forstørrelse. Figur 2A-C tilsvarer hjernestammen. Figur 2D-F</s...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues at JoVE.com

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Her presenterer vi en immunhiokjemisk testprotokoll for påvisning av rabiesvirusantigen som en alternativ diagnostisk test for formalin-fast vev.

Immunhiistokjemi Test for Lyssavirus Antigen Deteksjon fra Formalin-fast vev

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Vev som brukes til immunhiistokjemi og for diagnostisk histopatologi er rutinemessig løst i 10% fosfatbuffer formalin. Påvisning av rabiesvirusantigen i hjernevev som er løst i formalin presenterer en unik utfordring, og IHC-testen har vist seg å være en sensitiv og spesifikk metode for rabiesvirus antigendeteksjon. Den viktigste fordelen med biopsi eller andre deteksjonsmetoder er at antigener kan påvises i forhold til vev og cellulær morfologi.Med IHC, lokalisering av rabies antigen i hjernen og ikke-hjernevev, gi ytterligere informasjon som ikke kunne fås gjennom rutinemessige Hematoxylin og Eosin flekk seksjoner. Rabies diagnostisk testing er viktig for initiering av profylakse etter eksponering hos mennesker utsatt for rabiesvirus. IHC er en av de mest utførte analysene på formalin-fast vev.Med spesifikke antistoffer kan den brukes til påvisning av respektive patogener. For å starte denne prosedyren, plasser tre til fem millimeter biter av hjernevev, samlet etter nekropsi, i en 10% bufret formalinløsning i 24 til 72 timer. Registrer omtrentlig vevsvekt, vevstype og volumet av formalin.Plasser vevet i 70% etanol for lengre vevslagring etter formalinfiksering, og før behandling. Etter prøvefikseringen dissekerer du vevet for å inkludere de viktige hjerneområdene, for eksempel tverrsnitt av hjernestammen, cerebellum eller hippocampus. Hver, kutt til en tykkelse mellom tre og fem millimeter.Plasser vevet i behandlingskassetter. Behandle vevskassettene for parafinvoksinfiltrasjon. Bygg dem inn i parafinblokker og del dem på en mikrotom.Sett først opp fargefatet som beskrevet i figur 1 i tekstprotokollen. Fyll hver tallerken med 250 milliliter av den tilberedte løsningen. For å klargjøre AEC-substratbestandsløsningen, bruk en glasspipette for å oppløse en 20 milligram tablett AEC i 5 milliliter N, N-Dimethylformamid.For å forberede protease lagerløsningen, oppløs 7 milligram protease i 200 milliliter PBS. For å forberede skyllebufferen, tilsett 100 milliliter Tween 80 til 990 milliliter PBS, og bland godt for å danne en homogen løsning av PBT-T. Bruk en mikrotom, lag en fem mikrometer parafin seksjon.Legg delen på et vannbad ved 38 grader Celsius og samle den på glasssklier. Merk lysbildene med en reagensbestandig penn. Plasser lysbildene på et brett og smelt i en ovn ved 55 til 60 grader Celsius i en time.Fjern deretter lysbildene fra ovnen og deparaffiner dem umiddelbart ved hjelp av 3 påfølgende xylenskyllinger på 5 minutter hver. Etter dette rehydrerer du seksjonene på lysbildet ved sekvensielle nedsenkninger i avtagende fortynninger av etanol til deionisert vann, som beskrevet i tekstprotokollen. Behandle lysbildene med protease i 30 minutter for proteolytisk antigenuthenting, skyll deretter lysbildene i PBS-T i 10 minutter, og behandle dem med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter.Deretter vasker du lysbildene igjen med PBS-T i 10 minutter. Til å begynne med, fjern ett lysbilde fra bufferen, sørg for å bare håndtere ett lysbilde om gangen, mens de andre forblir nedsenket, og bruk et papirhåndkle for å flekke av overflødig buffer fra rundt vevsdelen. Plasser lysbildene i et fuktighetskammer og inkuber med normalt geitserum ved romtemperatur i 15 minutter.Deretter inkuberer du lysbildene i fuktighetskammeret med optimal forhåndsbestemt fortynning primær anti-rabies antistoff, og negative kontrollantistoffer, ved romtemperatur i 60 minutter uten vask i mellom. Deretter vasker du lysbildene med PBS-T i 10 minutter og inkuberer i et fuktighetskammer med det biotinylerte antistoffet ved romtemperatur i 15 minutter. Vask lysbildene igjen med PBS-T i 10 minutter.Inkuber lysbildene og fuktighetskammeret med stripedeling og HRB-kompleks ved romtemperatur i 15 minutter og vask PBS-T i 10 minutter. Deretter inkuberer du med AEC i et fuktighetskammer ved romtemperatur i 10 minutter. Vask lysbildene i deionisert vann i 10 minutter og motstain med Gills Hematoxilyn, fortynnet en til to med deionisert vann i to minutter.Etter dette, skyll av overflødig hematoksylin ved å dyppe skylle lysbildene i deionisert vann. Skyll skliene i Scotts vann fra springen i 30 sekunder og vask demionisert vann i 10 minutter. Fjern lysbildene en om gangen og monter dem med vannløselig monteringsmedium.Bruk deretter et lysmikroskop til å lese lysbildene. I denne studien er en immunocytisk kjemitest demonstrert for påvisning av rabiesvirusantigen som en alternativ diagnostisk test for formalin-fast vev. Et representativt immunocytisk kjemifargingsresultat av positive og negative kontrollprøver i forskjellige hjernevev er vist her, inkludert hjernestammen, cerebellum- og purkinjecellene og hippocampus.Den magenta røde fargingen, som indikerer fargeutviklingen ved å bruke AEC-substrat mot den blå motsponerte bakgrunnen, skyldes reaktivitet av antistoffer mot rabiesantigenet. Et positivt resultat i immunhiistokjemi tilsvarer den magentarøde fargingen i vevsseksjonene. Farging av cytoplasmatiske inneslutninger og granulære inneslutninger av varierende størrelse indikerer prøver som er positive for RABV-infeksjoner.Prøver anses som negative hvis ingen spesifikk rød farging eller bare den blå bakgrunnen, på grunn av hematoksylin, ble observert. I tillegg til den positive fargingen, kan fordelingen av inneslutninger gi indirekte kvantifisering av nivåer av rabiesantigen i prøven, noe som kan tilsvare den virale belastningen av vevsprøven. Uavhengig av distribusjonsnivåene, vil enhver spesifikk farging klassifisere prøven som positiv for RABV antigendeteksjon.Vev bør festes tilstrekkelig i formalin, og unngå frysing av vevet under denne prosessen. Rabies antigen oppdages av IHC, deretter molekylære teknikker kan utføres på parafin seksjoner for å bestemme Lyssavirus variant basert på RNA sekvensinformasjon. Reagenser som xylen og formalin skal håndteres i avtrekkshetter.Forsiktighet bør utvises under håndtering av AEC da det er et kreftfremkallende middel.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Diagnostisering lungetuberkulose med Xpert MTB / RIF Test

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

En roman microdissection tilnærming til Gjenopprette<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spesifikke Utskrift fra formalinfiksert parafin Embedded Lung Granulomer

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Påvisning av humant leukocytt antigen Biomarkører i Breast Cancer Utnytte Etikett-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Nasal Wipes for influensa A virus Detection og isolering mot svine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Generering av To-farge Antigen Mikromatriser for samtidig påvisning av IgG og IgM autoantistoffer

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Oppdagelse og berikelse av Rare antigen-spesifikke B-celler for analyse av fenotype og funksjon

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering og karakterisering rensing av makrofager fra vev av fedme-relaterte betennelse

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

I Vivo Analysen for påvisning av Antigen-spesifikke T-celle Cytolytic funksjon med en vaksinasjon modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...