Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

Den HC11 celle linje blev venligt leveret af Dr. D. Medina (Houston, TX). Forfatterne er taknemmelige for Dr. Andrew Craig fra Queen's University for mange reagenser og værdifulde forslag. EpH4 celler var en gave fra Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ydede fremragende teknisk bistand til 3D-kulturstudier.
Den finansielle bistand fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), den canadiske Institutes of Health Research (CIHR), den canadiske Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario kapitel), den canadiske Breast Cancer Research Alliance , Ontario Centre of Excellence, Breast Cancer Action Kingston (BCAK) og Clare Nelson arv fond gennem tilskud til LR er taknemmeligt anerkendt. BE modtaget tilskud støtte fra CIHR, CBCF, BCAK og Cancer Research Society Inc. PTG er støttet af en Canada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC og Canadian Cancer Society. MN blev støttet af et studenterprogram fra Terry Fox Training Program i Transdisciplinary Cancer Research fra NCIC, en Graduate award (QGA), og en Dean's Award fra Queen's University. MG blev støttet af postdoc stipendier fra den amerikanske hær Breast Cancer Program, Ministeriet for Forskning og Innovation i provinsen Ontario og det rådgivende forskningsudvalg for Queen's University. VH blev støttet af en CBCF ph.d.-stipendium og en postdoc stipendium fra Terry Fox Foundation Training Program i Tværfaglig Cancer Research i partnerskab med CIHR. Hanad Adan var modtager af et NSERC sommerstudenteri. BS blev støttet af en Queen's University graduate award.

1. Plating HC11 Celler
<ol><li>I en laminar flow hætte ved hjælp af sterile teknikker forberede en flaske med 50 ml HC11 celle medium: RPMI-1640 med 10% føtal kvæg serum (FBS), 5 μg/ml insulin, og 10 ng /mL EGF (se Tabel over materialer).</li>
	<li>Plade ca 400.000 celler pr 3 cm petriskål: Pass to 10 cm, 50% sammenflydende Petri retter i tyve 3 cm retter i HC11 medium. Cellerne skal være godt spredt ud, men tørring skal undgås.<ol>
<li>Aspirere mediet ind i en kolbe ved hjælp af en vakuumpum...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

HC11 celler er velegnede til studiet af differentiering i forbindelse med neoplastisk transformation. En ekstra fordel er, at HC11 celler er let inficeres med Mo-MLV-baserede retrovirale vektorer til at udtrykke en række gener. I vores hænder, EpH4 celler var vanskeligere at inficere med de samme retrovirale vektorer end HC112.
Celle-til-celle kontakt og vækst anholdelse er centrale forudsætninger for HC11 celle differentiering. Således, for at opnå ensartet diffe...

I normale væv eller tumorer, celler har omfattende muligheder for vedhæfte til deres naboer i en tre-dimensionel organisation, og dette efterlignes i kultur ved høj tæthed cellevækst. Celle-til-celle vedhæftning formidles hovedsageligt gennem cadherin receptorer, som definerer celle og væv arkitektur. Interessant, det blev for nylig vist, at cadherins også spille en stærk rolle i signal transduktion, især i overlevelse signalering1. Paradoksalt nok, nogle af disse celle-til-celle vedhæftning signaler stammer fra cadherins blev for nylig anset for at være delt af både differentiering og neoplasi2. Her beskriver vi metoder til induktion og vurdering af differentiering i to repræsentative typer af musebryst epitelcellelinjer, HC11 og EpH4.
HC11 mus bryst epitelcellelinje kan give en nyttig model for studiet af epitelcelle differentiering. HC11 celler er en KOMMA-1D-afledt cellelinje, der stammer fra mælkekirtlen i en midgravid Balb/c mus3. I modsætning til andre KOMMA-1D-afledte kloner har HC11-klonen ikke noget krav om udefrakommende tilsat ekstracellulær matrix eller samdyrkning med andre celletyper til in vitroinduktion af det endogene β-kaseingen ved laktogene hormoner3. Denne cellelinje er blevet anvendt i udstrakt grad i differentieringsundersøgelser, fordi den har bevaret vigtige egenskaber ved det normale mælkeepitel: HC11-celler kan delvist rekonstruere kanalepitel i en renset mælkefedtpude4. Desuden, de kan differentiere i en to-dimensionel (2D) kultur, når de dyrkes til sammenløb knyttet til en plast Petri skål overflade i overværelse af et steroid som Hydrocortison eller Dexamethason, ud over jegnsulin og Prolactin (HIP medium) mangler epidermal vækstfaktor (EGF), en hæmmer af differentiering5,6,7. Under disse omstændigheder producerer HC11-celler mælkeproteiner såsom β-kasein og WAP, som kan påvises ved vestlig blotting inden for 4 dage efter induktion. Samtidig danner en del af HC11 celler rudimentære mælkekirtellignende strukturer, der kaldes "kupler" på en stokastisk måde. Kupler er synlige 4-5 dage efter induktion og gradvist stigning i størrelse op til dag 10, samtidig med en stigning i β-kasein produktion8. Interessant, HC11 celler besidder mutant p539, og derfor repræsenterer en præneoplastisk tilstand. Af denne grund er HC11-modellen velegnet til at studere signalnetværk af differentiering i forbindelse med neoplasi i samme cellesystem.
EpH4 celler, et derivat af IM-2 celler, er en nontumorigenic celle linje oprindeligt stammer fra spontant udødeliggjort mus mælkekirtlen epitel epitel epitelceller isoleret fra en mid-gravid Balb /c mus10. EpH4 celler danner kontinuerlig epitelmonolag i 2D-kultur, men skelner ikke i kirtellignende strukturer10,11. Men efter 3D-vækst i et materiale, der består af en blanding af ekstracellulære matrix proteiner produceret af EHS mus sarkomceller12 (EHS matrix, matrix, eller Matrigel, se Tabel over materialer),ud over stimulation med HIP, EpH4 celler kan opsummere de indledende faser af mælkekirtlen differentiering. Under disse betingelser danner EpH4-celler sfæller (også kaldet mammøsfærer), der udviser apical-basal polaritet og et hult lumen, og er i stand til at producere mælkeproteiner β-kasein og WAP, svarende til lakterende mælkeepitelceller. I modsætning til HC11 celler, som er udifferentierede, og nogle udtrykke mesenkymale markører13, EpH4 celler udviser en rent luminal morfologi14. EpH4 celler er også blevet rapporteret til at producere mælkeproteiner i 2D-kultur gennem stimulation med dexamethason, insulin, og prolaktin15. Men, denne tilgang udelukker undersøgelse af lovgivningsmæssige virkninger, der efterligner mælkekirtlen mikromiljø i 3D-kultur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Cadherins spiller en vigtig rolle i reguleringen af celledifferentiering samt neoplasi. Her beskriver vi oprindelsen og metoderne til induktion af differentiering af to musebryst epitelcellelinjer, HC11 og EpH4, og deres anvendelse til at studere komplementære stadier af mælkekirtlen udvikling og neoplastiske transformation.
DEN HC11 mus bryst epitelcelle linje stammer fra mælkekirtlen af en gravid Balb / c mus. Det differentierer, når de dyrkes til sammenløb knyttet til en plast Petri skål overflade i medium, der indeholder føtal kalv serum og Hydrocortison, jegnsulin og Prolactin (HIP medium). Under disse betingelser producerer HC11-celler mælkeproteiner β-kasein og vallesyreprotein (WAP), svarende til diegivende mælkeepitelceller, og danner rudimentære mælkekirtellignende strukturer kaldet "kupler".
Den EpH4 cellelinje blev afledt af spontant udødeliggjort mus mælkekirtlen epitel epitel celler isoleret fra en gravid Balb / c mus. I modsætning til HC11, EpH4 celler kan fuldt ud differentiere sig i sfæller (også kaldet mammosfærer), når dyrket under tre-dimensionelle (3D) vækstbetingelser i HIP medium. Celler trypsiniseres, suspenderes i en 20% matrix bestående af en blanding af ekstracellulære matrix proteiner produceret af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkomceller, belagt oven på et lag koncentreret matrix belægning en plast petriskål eller flerbrøndplade, og dækket med et lag på 10% matrix-holdige HIP medium. Under disse betingelser danner EpH4-celler hule sfæller, der udviser apical-basal polaritet, en hul lumen og producerer β-kasein og WAP.
Ved hjælp af disse teknikker, vores resultater viste, at intensiteten af cadherin / Rac signal er afgørende for differentiering af HC11 celler. Mens Rac1 er nødvendig for differentiering og lave niveauer af aktiveret RacV12 øge differentiering, høje RacV12 niveauer blokere differentiering samtidig inducerende neoplasi. I modsætning hertil repræsenterer EpH4-celler en tidligere fase i mælkeepiteldifferentiering, som hæmmes af selv lave niveauer af RacV12.

Det har længe været kendt, at differentieringen af epitelceller og adipocytter kræver sammenløb og engagement af cadherins2. Vi og andre viste, at celle-til-celle vedhæftning og engagement af E- eller N-cadherin og cadherin-11, som opstår med sammenløbet af dyrkede celler, udløser en dramatisk stigning i aktiviteten af den lille GTPases Rac og celle division kontrol protein 42 (Cdc42), og denne proces fører til aktivering af interleukin-6 (IL6) familie cytokiner og Stat3 (signal transduce...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Vi beskriver teknikker til differentiering induktion af to bryst epitellinjer, HC11 og EpH4. Mens begge kræver føtal kalv serum, insulin, og prolaktin til at producere mælkeproteiner, EpH4 celler kan fuldt ud differentiere sig i mammsfærer i tre-dimensionel kultur. Disse komplementære modeller er nyttige til undersøgelser af signaltransduktion af differentiering og neoplasi.

Differentiering af mus bryst epitel HC11 og EpH4 Celler

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

HC11 og EpH4 celler er mus bryst epitelcellelinjer, som kan differentiere i kultur. Samtidig kan disse celler omdannes af en række onkogener. Disse celler er ideelle til studiet af det indbyrdes forhold mellem differentiering og den neoplastiske transformation.Disse teknikker kan bruges i signal transduktion undersøgelser for at opdage mål for kræftbehandling. For eksempel kan den lille GTPase Rac og andre molekyler udløse transformation af bryst epitelceller, når udtrykt til høje niveauer, men overraskende ved lave niveauer, de kan fremkalde differentiering. Andre signaltransducere kan opføre sig på samme måde.Principperne kan gælde for andre former for differentiering samt hvor celle sammenløb spiller en vigtig rolle, for eksempel differentiering af adipocytter eller myotubes. Nogen udfører denne teknik for første gang bør huske på, at plating af HC11 celler er vigtig. Dette skyldes, at celle-til-celle kontakt er vigtig for differentiering.Et andet punkt at holde øje med er, at korrekt ekstraktion af EpH4 celler fra matrixen er afgørende for proteinmængden, fordi eventuelle rester vil påvirke proteinbestemmelsen. Visuel demonstration af denne metode er nyttig, fordi nogle detaljer i protokollen er svære at beskrive på papir. Start med at forberede en flaske 50 milliliter HC11 cellemedium i henhold til manuskriptretninger.At plade cellerne, aspirere mediet fra fem seks centimeter 50% sammenløbet petriskåle og vaske cellerne med ca 1,8 milliliter trypsin ved hjælp af en steril ni tommer bomuld tilsluttet Pasteur pipette. Derefter tilsættes 200 mikroliter trypsin pr plade og hvirvle pladen til at løsne de vedhæftede celler. Overhold cellerne under fasekontrastmikroskopi med en 4X målsætning for at sikre, at de er begyndt at løsne.Derefter aspirere ca 1,5 milliliter HC11 medium med en steril ni tommer Pasteur pipette og sprøjte det lodret mod cellerne, mens du roterer skålen og sørg for at undgå sprøjt. Overfør alle cellerne til flasken med HC11 medium og hvirvler for at sprede jævnt i flasken. Derefter aliquot cellen suspension i 20 tre centimeter petriskåle ved pipettering to milliliter celler pr fad.Rock petriskålene for at sprede cellerne og inkubere dem ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid natten over. Den næste dag, når cellerne er 90 til 100%sammenløb, aspirere mediet og erstatte det med medium med FBS, men uden EGF. Efter dyrkning af cellerne i medium uden GLOBALISERING i 24 timer, tilsæt differentieringsmediet til 10 retter og dyrk cellerne i op til 10 dage, så de andre 10 retter som kontrol.Skift mediet hver anden til tredje dag med både HIP-behandlede celler og kontrolceller. For at overvåge differentieringen observeres cellerne med fasekontrastmikroskopi. Brug fluorescensmikroskopi, hvis cellerne udtrykker grønt fluorescerende protein.Derudover kvantificeres differentieringen ved at udvinde proteiner fra hip-behandlede celler og kontrolceller én gang om dagen og udføre Western Blot-analyse. Saml og placer EpH4 vækstmediet, EHS-matrixen og to koniske 50 milliliterrør på is. Prechill vævskulturpladerne med pipettespidser ved minus 20 grader Celsius og forbered EpH4 vækstmedium suppleret med 10 eller 20% matrix i to 50 milliliter koniske rør og hold dem på is, indtil de er klar til brug.Efter at have hentet de forskudte vævskulturplader ved minus 20 grader Celsius, pels 10 brønde af den 24-brøndplade med 150 mikroliter ufortyndet matrix ved at sprede matrixen med en pipette. Undgå at oprette bobler, når du spreder matrixen. Bank derefter forsigtigt på siderne af pladen og inkuber pladen ved 37 grader Celsius i en time for at gøre det muligt for matrixen at størkne.I mellemtiden forberede differentiering ved trypsinizing EpH4 celler samt tidligere beskrevet og sikre enkelt celle suspensioner efter resuspension af trypsinized celler. Dernæst tælle cellerne i suspension med et hæmocytometer. Overfør fem gange 10 til de fire celler pr. brønd til et 1,5 milliliter sterilt konisk centrifugerør og drej dem ved 250 gange g i fem minutter.Inspirer forsigtigt supernatantmediet og læg røret på is. Brug en en milliliter pipettespids til at opslænne cellerne i 350 mikroliter af EpH4 vækstmedium suppleret med 20%matrix, samtidig med at rørene på isen sørger for at undgå bobler. Når det nederste lag er størknet, tilsættes de 350 mikroliter af celleaffjedring til hver belagt brønd og placere den i en kuldioxid inkubator på 37 grader Celsius i en time for at tillade 20% matrix lag til at størkne.Overhold cellerne med fasekontrastmikroskopi for at sikre, at enkelte celler er synlige. Derefter tilsættes 200 mikroliter eph4 medium med 10% matrix på toppen og inkubere pladen ved 37 grader Celsius. Begynd differentiering induktion en dag efter plating cellerne i matrixen.Fjern omhyggeligt 150 mikroliter af top 10%matrix medium og tilsæt 200 mikroliter eph4 medium, der indeholder HIP og 10%matrix og for kontrol tilføje en 10%matrix medium uden HIP. Udskift mediet hver anden dag i op til 10 dage overvågning mammosphere dannelse med fase kontrast mikroskopi. For at kvantificere differentieringen pipetters forsigtigt 10%matrix HIP-mediet fra brøndene og skyl 20%matrixlaget med 350 mikroliter iskoldt PBS.Derefter tilsættes 70 til 100 mikroliter iskold PBS med en millimolar EDTA direkte ind i brøndene og forsigtigt løsne det nederste lag af 100%matrix med en pipette spids. Ryst pladen forsigtigt ved fire grader Celsius i 30 minutter. Overfør forsigtigt sfærisk suspension til et konisk rør og skyl brøndene med 500 mikroliter PBS EDTA for at genvinde eventuelle resterende sfæroider.Rock røret på is i yderligere 30 minutter og sørg for, at matrixen opløses helt. Hvis der ses synlige matrixklumper, tilsættes mere PBS EDTA eller rystes længere. Centrifuge opløsningen ved 350 gange g for at pelletere sfæroiderne.Derefter aspirere supernatant, lyse sfæroider, og sonde cellerne til beta-casein, cyclin D1, og p120RasGAP ved vestlige blotting. Der er en slående afhængighed af differentiering på styrken af Rac signal i HC11 celler. Mens endogene CRAC1 er nødvendig for differentiering og lave niveauer af mutationsaktiveret RacV12 forårsage en stigning i differentiering kapacitet, høj RacV12 niveauer udløse en blok af differentiering og fremkalde neoplasi.Når differentieringsegenskaberne for EpH4-celler blev undersøgt i en 3D-matrixkultur, blev det konstateret, at beta-caseinproduktionen toppede ved otte til 10 dage, og cyclin D1-udtrykket var maksimalt fire til seks dage efter HIP-stimulation. For at bestemme placeringen af de enkelte celler, blev de plettet med DAPI og afbildet med konfokal mikroskopi. Indre celle død og dannelse af hule lumen blev observeret i mammospheres mens tilsætning af HGF resulterede i dannelsen af rørformede strukturer.Nogen udfører denne teknik for første gang bør huske på, at plating af HC11 celler er vigtig. Også korrekt ekstraktion af EpH4-cellerne fra matrixen er afgørende for proteinmængden, fordi eventuelle rester vil påvirke proteinbestemmelsen. Denne teknik kan bruges til at undersøge andre signaltransducere, der kan opføre sig på samme måde.Hvis der er driver mutationer i en kræft, så deres fuldstændige hæmning vil ikke være nødvendigt, da lave niveauer tilbage rent faktisk ville fremkalde differentiering.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Syntese og karakterisering af en Aspirin-fumarat prodrug, Hæmmer NFKB Aktivitet og brystkræft Stamceller

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Opførsel af humane brystcancerceller i embryonale zebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live imaging bryst epitelcelle migration efter forbigående nedbrydningen af TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic injektion af brystkræftceller ind i musene brystkirtler fedt Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modellering brystkræft via en intraductal injektion af CRE-udtrykker adenovirus i mus Brystkirtlen

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluering af differentierings kapaciteten af mus prostata Epiteliale celler ved hjælp af Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Ortotopisk transplantation af brysttumorer som prækliniske modeller for brystkræft

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering af onkogene transformation i humane mammary epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funktionel vurdering af stamceller fra brystkræft fra celle- og vævsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Undersøgelse TGF-β Signalering og TGF-β-induceret Epitel-til-mesenchymal Overgang i brystkræft og normale celler

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...