Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

De HC11 cellijn werd vriendelijk verstrekt door Dr. D. Medina (Houston, TX). De auteurs zijn dr. Andrew Craig van Queen's University dankbaar voor vele reagentia en waardevolle suggesties. EpH4 cellen waren een geschenk van Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick leverde uitstekende technische ondersteuning voor 3D-cultuurstudies.
De financiële steun van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), de Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), de Canadian Breast Cancer Research Alliance , de Ontario Centres of Excellence, de Breast Cancer Action Kingston (BCAK) en de Clare Nelson legaat fonds door middel van subsidies aan LR is dankbaar erkend. BE ontving subsidiesteun van CIHR, CBCF, BCAK en Cancer Research Society Inc. PTG wordt ondersteund door een Canada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC en Canadian Cancer Society. MN werd ondersteund door een studentenschap van het Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research van NCIC, een Graduate award (QGA), en een Dean's Award van Queen's University. MG werd ondersteund door postdoctorale beurzen van het Us Army Breast Cancer Program, het Ministerie van Onderzoek en Innovatie van de provincie Ontario en de Advisory Research Committee van Queen's University. VH werd ondersteund door een CBCF doctoraatsbeurs en een postdoctorale beurs van de Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinaire Cancer Research in samenwerking met CIHR. Hanad Adan ontving een NSERC zomerstudentenschip. BS werd ondersteund door een Queen's University graduate award.

1. Beplating HC11 Cellen
<ol><li>In een laminaire stroomkap met behulp van steriele technieken bereiden een fles met 50 mL HC11 celmedium: RPMI-1640 met 10% foetaal runderserum (FBS), 5 μg/mL insuline en 10 ng/mL EGF (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Plaat ongeveer 400.000 cellen per 3 cm petrischaal: Pass twee 10 cm, 50% confluent Petri gerechten in twintig 3 cm gerechten in HC11 medium. De cellen moeten goed worden verspreid, maar drogen moet worden vermeden.<ol>
<li>Zuig het medium aan in een k...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

HC11 cellen zijn bij uitstek geschikt voor de studie van differentiatie in combinatie met neoplastische transformatie. Een bijkomend voordeel is dat HC11-cellen gemakkelijk te infecteren zijn met Mo-MLV-gebaseerde retrovirale vectoren om een verscheidenheid aan genen uit te drukken. In onze handen, EpH4 cellen waren moeilijker te infecteren met dezelfde retrovirale vectoren dan HC112.
Cell-to-cell contact en groeiarrestatie zijn belangrijke voorwaarden voor HC11 celdiff...

In normale weefsels of tumoren, cellen hebben uitgebreide mogelijkheden voor hechting aan hun buren in een driedimensionale organisatie, en dit wordt nagebootst in cultuur door hoge dichtheid celgroei. Cel-op-cel hechting wordt voornamelijk bemiddeld via cadherinreceptoren, die cel- en weefselarchitectuur definiëren. Interessant is dat onlangs werd aangetoond dat cadherinen ook een krachtige rol spelen bij signaaltransductie, vooral bij overlevingssignalering1. Paradoxaal genoeg bleken sommige van deze cel-op-cel hechtingssignalen afkomstig van cadherinen onlangs te worden gedeeld door zowel differentiatie als neoplasie2. Hier beschrijven we methoden voor inductie en beoordeling van differentiatie in twee representatieve soorten muisborst epitheliale cellijnen, HC11 en EpH4.
De HC11 muisborst epitheliale cellijn kan een nuttig model voor de studie van epitheelceldifferentiatie. HC11 cellen zijn een COMMA-1D-afgeleide cellijn, afkomstig van de borstklier van een halfzwangere Balb/c muis3. In tegenstelling tot andere COMMA-1D afgeleide klonen, de HC11 kloon heeft geen behoefte aan exogene toegevoegde extracellulaire matrix of coteelt met andere celtypes voor de in vitro inductie van het endogene β-caseingen door lactogene hormonen3. Deze cellijn is op grote schaal gebruikt in differentiatiestudies omdat het belangrijke kenmerken van het normale borstepitheel heeft behouden: HC11-cellen kunnen het kanaalepitheel gedeeltelijk reconstrueren in een gewist borstvetpad4. Bovendien kunnen ze zich onderscheiden in een tweedimensionale (2D) cultuur wanneer ze worden gekweekt tot samenvloeiing aan een plastic petrischaaloppervlak in aanwezigheid van een steroïde zoals Hydrocortison of Dexamethason, naast Insulin en Prolactin (HIP medium) die epidermale groeifactor (EFG) missen, een remmer van differentiatie5,6,7. Onder deze omstandigheden produceren HC11-cellen melkeiwitten zoals β-caseïne en WAP, die binnen 4 dagen na inductie door westerse vlekken kunnen worden gedetecteerd. Tegelijkertijd vormt een deel van hc11 cellen rudimentaire borstklierachtige structuren die op een stochastische manier "koepels" worden genoemd. Koepels zijn zichtbaar 4-5 dagen na inductie en geleidelijk toenemen in omvang tot dag 10, gelijktijdig met een toename van β-caseine productie8. Interessant is dat HC11 cellen bezitten mutant p539, en dus vertegenwoordigen een preneoplastic staat. Om deze reden is het HC11-model bij uitstek geschikt om signaleringsnetwerken van differentiatie te bestuderen in combinatie met neoplasie in hetzelfde celsysteem.
EpH4 cellen, een afgeleide van IM-2 cellen, zijn een niet-tumorigene cellijn oorspronkelijk afgeleid van spontaan vereeuwigde muis borstklier epitheelcellen geïsoleerd van een mid-zwangere Balb / c muis10. EpH4 cellen vormen continue epitheelmonolagen in de 2D-cultuur, maar onderscheiden zich niet in klierachtige structuren10,11. Echter, na 3D-groei in een materiaal bestaande uit een mengsel van extracellulaire matrix eiwitten geproduceerd door EHS muis sarcoom cellen12 (EHS matrix, matrix, of Matrigel, zie Tabel met materialen), in aanvulling op stimulatie met HIP, EpH4 cellen kunnen recapituleren de eerste stadia van borstklier differentiatie. Onder deze omstandigheden vormen EpH4-cellen sferoïden (ook wel mammosferen genoemd) die apical-basale polariteit en een holle lumen vertonen, en die in staat zijn de melkeiwitten β-caseïne en WAP te produceren, vergelijkbaar met zogende borstepitheelcellen. In tegenstelling tot HC11 cellen, die ongedifferentieerd zijn, en sommige uitdrukken mesenchymale markers13, EpH4 cellen vertonen een zuiver luminale morfologie14. EpH4 cellen zijn ook gemeld aan melkeiwitten te produceren in 2D-cultuur door stimulatie met dexamethason, insuline, en prolacactine15. Deze aanpak sluit echter de studie uit van regelgevende effecten die de borstkliermicroomgeving in de 3D-cultuur nabootsen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Cadherinen spelen een belangrijke rol in de regulering van celdifferentiatie en neoplasie. Hier beschrijven we de oorsprong en methoden van de inductie van differentiatie van twee muisborst epitheliale cellijnen, HC11 en EpH4, en het gebruik ervan om complementaire stadia van borstklierontwikkeling en neoplastische transformatie te bestuderen.
De HC11 muisborst epitheliale cellijn is afkomstig van de borstklier van een zwangere Balb/c muis. Het onderscheidt wanneer gekweekt aan samenvloeiing die aan een plastic petrischaaloppervlak in middel met foetale kalfsserum en Hydrocortisone, Iknsulin en Prolactin (ship medium) wordt vastgemaakt. Onder deze omstandigheden produceren HC11-cellen de melkeiwitten β-caseïne en weizuureiwit (WAP), vergelijkbaar met zogende borstepitheelcellen, en vormen rudimentaire borstklierachtige structuren die "koepels" worden genoemd.
De EpH4 cellijn is afgeleid van spontaan vereeuwigde muisborstklier epitheelcellen geïsoleerd van een zwangere Balb/c muis. In tegenstelling tot HC11 kunnen EpH4-cellen zich volledig onderscheiden in sferoïden (ook wel mammosferen genoemd) wanneer ze worden gekweekt onder driedimensionale (3D) groeiomstandigheden in HIP medium. Cellen worden beproefd, opgehangen in een 20% matrix bestaande uit een mengsel van extracellulaire matrix eiwitten geproduceerd door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen, verguld op de top van een laag geconcentreerde matrix coating een plastic petrischaal of multiwell plaat, en bedekt met een laag van 10% matrix-bevattende HIP medium. Onder deze omstandigheden vormen EpH4-cellen holle sferoïden die apical-basale polariteit vertonen, een holle lumen, en β-caseine en WAP produceren.
Met behulp van deze technieken, onze resultaten aangetoond dat de intensiteit van de cadherin / Rac signaal is van cruciaal belang voor de differentiatie van HC11 cellen. Terwijl Rac1 is noodzakelijk voor differentiatie en lage niveaus van geactiveerde RacV12 verhoging differentiatie, hoge RacV12 niveaus blok differentiatie terwijl het induceren van neoplasie. EpH4-cellen daarentegen vertegenwoordigen een vroeger stadium in borstepitheeldifferentiatie, die wordt geremd door zelfs lage niveaus van RacV12.

Het is al lang bekend dat de differentiatie van epitheelcellen en adipocyten samenvloeiing en betrokkenheid van cadherinenvereist 2. Wij en anderen hebben aangetoond dat cel-op-cel hechting en betrokkenheid van E- of N-cadherine en cadherin-11, zoals gebeurt met de samenvloeiing van gekweekte cellen, leidt tot een dramatische toename van de activiteit van de kleine GTPases Rac en celdeling controle eiwit 42 (Cdc42), en dit proces leidt tot activering van interleukine-6 (IL6) familie cytokines en S...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

We beschrijven technieken voor differentiatie-inductie van twee borstepitheellijnen, HC11 en EpH4. Terwijl beide foetale kalf serum, insuline, en prolacactine nodig om melkeiwitten te produceren, EpH4 cellen kunnen volledig onderscheiden in mammosferen in driedimensionale cultuur. Deze complementaire modellen zijn nuttig voor signaaltransductiestudies van differentiatie en neoplasie.

Differentiatie van muisborst epitheel HC11 en EpH4 Cellen

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

De HC11- en EpH4-cellen zijn epitheelcellijnen van muizenborsten die zich kunnen onderscheiden in de cultuur. Tegelijkertijd kunnen deze cellen worden getransformeerd door een aantal oncogenen. Deze cellen zijn ideaal voor de studie van de onderlinge relatie tussen differentiatie en de neoplastische transformatie.Deze technieken kunnen worden gebruikt in signaaltransductiestudies om doelen voor kankertherapie te ontdekken. Bijvoorbeeld, de kleine GTPase Rac en andere moleculen kunnen leiden tot transformatie van borstepepitheelcellen wanneer uitgedrukt in hoge niveaus, maar verrassend op lage niveaus, kunnen ze leiden tot differentiatie. Andere signaaltransducers kunnen zich op dezelfde manier gedragen.De beginselen kunnen ook van toepassing zijn op andere vormen van differentiatie wanneer celvloeiing een belangrijke rol speelt, bijvoorbeeld differentiatie van adipocyten of myobuizen. Iemand die deze techniek voor de eerste keer moet in gedachten houden dat beplating van de HC11 cellen belangrijk is. Dit komt omdat cel-naar-cel contact belangrijk is voor differentiatie.Een ander punt om op te letten is dat een goede extractie van EpH4-cellen uit de matrix van cruciaal belang is voor eiwitkwantificering, omdat eventuele residuen de eiwitbepaling beïnvloeden. Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat sommige details van het protocol op papier moeilijk te beschrijven zijn. Begin met het bereiden van een fles van 50 milliliter HC11 celmedium volgens manuscriptaanwijzingen.Om de cellen plaat, aspirate het medium van vijf zes centimeter 50%confluent Petri gerechten en was de cellen met ongeveer 1,8 milliliter trypsine met behulp van een steriele negen inch katoen aangesloten Pasteur pipet. Voeg vervolgens 200 microliter trypsine per plaat toe en draai de plaat om de bijgevoegde cellen los te maken. Observeer de cellen onder fasecontrast microscopie met een 4X doelstelling om ervoor te zorgen dat ze zijn begonnen te verjagen.Dan aspirate ongeveer 1,5 milliliter HC11 medium met een steriele negen inch Pasteur pipet en spuit het verticaal tegen de cellen tijdens het draaien van de schotel om ervoor te zorgen dat spatten te voorkomen. Breng alle cellen naar de fles met HC11 medium en wervelen gelijkmatig te verspreiden in de fles. Dan aliquot de cel suspensie in 20 drie centimeter Petri gerechten door pipetting twee milliliter cellen per schotel.Rock de petrischaaltjes om de cellen te verspreiden en ze 's nachts uit te broeden op 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Op de volgende dag, wanneer de cellen 90 tot 100% confluent zijn, het medium aanzuigen en vervangen door medium met FBS, maar zonder EFG. Na het kweken van de cellen in medium zonder EGF voor 24 uur, voeg de differentiatie medium tot 10 gerechten en groeien de cellen voor maximaal 10 dagen houden van de andere 10 gerechten als controles.Verander het medium om de twee tot drie dagen met zowel HIP behandeld en controle cellen. Als u de differentiatie wilt controleren, moet u de cellen observeren met een fasecontrastmicroscopie. Gebruik fluorescentiemicroscopie als de cellen groene fluorescerende eiwitten uitdrukken.Bovendien kwantificeren van de mate van differentiatie door het extraheren van eiwitten uit de HIP behandelde en controlecellen eenmaal per dag en het uitvoeren van Western Blot analyse. Verzamel en plaats het EpH4 groeimedium, de EHS-matrix en twee conische buizen van 50 milliliter op ijs. Prechill de weefselkweek platen met pipet tips op min 20 graden Celsius en bereid EpH4 groeimedium aangevuld met 10 of 20%matrix in twee 50 milliliter conische buizen en houd ze op ijs tot klaar voor gebruik.Na het ophalen van de gepekaerde weefselkweekplaten bij min 20 graden Celsius, bedekt u 10 putten van de 24-putplaat met 150 microliters onverdund matrix door de matrix met een pipet te verspreiden. Vermijd het creëren van bubbels bij het verspreiden van de matrix. Tik vervolgens voorzichtig op de zijkanten van de plaat en broed de plaat een uur lang uit op 37 graden Celsius om de matrix te laten stollen.Bereid u ondertussen voor op de differentiatie door de EpH4-cellen goed te trypsiniseren zoals eerder beschreven en te zorgen voor eencellige suspensies na resuspensie van trypsinized cellen. Tel vervolgens de cellen in suspensie met een hemocytometer. Breng vijf keer 10 naar de vier cellen per put naar een 1,5 milliliter steriele kegelvormige centrifuge buis en draai ze op 250 keer g gedurende vijf minuten.Voorzichtig aspirate het supernatant medium en plaats de buis op ijs. Gebruik een 1 milliliter pipettip om de cellen opnieuw op te hangen in 350 microliter van EpH4 groeimedium aangevuld met 20%-matrix terwijl de buizen op ijs blijven om bubbels te voorkomen. Zodra de onderste laag is gestold, voeg de 350 microliters van cel suspensie aan elke gecoate put en plaats het in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende een uur om de 20% matrix laag te stollen.Observeer de cellen met fasecontrastmicroscopie om ervoor te zorgen dat enkele cellen zichtbaar zijn. Voeg vervolgens 200 microliter eph4-medium met 10% matrix erop toe en broed de plaat uit op 37 graden Celsius. Begin differentiatie inductie een dag na het plating van de cellen in de matrix.Verwijder voorzichtig 150 microliter van top 10%matrix medium en voeg 200 microliter van EpH4 medium met HIP en 10% matrix en voor controles voeg een 10% matrix medium zonder HIP. Vervang het medium om de twee dagen gedurende maximaal 10 dagen door mammosfeervorming te monitoren door fasecontrastmicroscopie. Om de differentiatie te kwantificeren, voorzichtig pipette uit de 10%-matrix HIP medium uit de putten en spoel de 20% matrix laag met 350 microliters van ijskoude PBS.Voeg vervolgens 70 tot 100 microliters ijskoude PBS toe met één millimolar EDTA direct in de putten en maak voorzichtig de onderste laag van 100% matrix los met een pipetpunt. Schud de plaat gedurende 30 minuten zachtjes op vier graden Celsius. Breng de sferoïde suspensie voorzichtig over naar een conische buis en spoel de putten af met 500 microliter PBS EDTA om eventuele resterende sferoïden terug te krijgen.Rock de buis nog eens 30 minuten op ijs om ervoor te zorgen dat de matrix volledig oplost. Als zichtbare matrixklontjes worden gezien, voeg dan meer PBS EDTA toe of schud langer. Centrifugeren de oplossing op 350 keer g om de sferoïden pellet.Dan aspirate de supernatant, lyse de sferoïden, en sonde de cellen voor beta-caseïne, cyclische D1, en p120RasGAP door westerse blotting. Er is een opvallende afhankelijkheid van differentiatie op de sterkte van het Rac-signaal in HC11-cellen. Terwijl endogene CRAC1 nodig is voor differentiatie en lage niveaus van mutatiegeactiveerde RacV12 een toename van differentiatiecapaciteit veroorzaken, leiden hoge RacV12-niveaus tot een blok van differentiatie en veroorzaken neoplasie.Toen de differentiatie-eigenschappen van EpH4-cellen werden onderzocht in een 3D-matrixcultuur, bleek dat de bèta-caseïneproductie piekte op acht tot tien dagen en de cyclische D1-expressie maximaal was op vier tot zes dagen na HIP-stimulatie. Om de positionering van individuele cellen te bepalen, werden ze bevlekt met DAPI en afgebeeld met confocale microscopie. Innerlijke celdood en vorming van holle lumen werd waargenomen in de mammospheres, terwijl toevoeging van HGF resulteerde in de vorming van buisvormige structuren.Iemand die deze techniek voor de eerste keer moet in gedachten houden dat de beplating van de HC11 cellen belangrijk is. Ook een goede extractie van de EpH4-cellen uit de matrix is van cruciaal belang voor eiwitkwantificering, omdat eventuele residuen de eiwitbepaling beïnvloeden. Deze techniek kan worden gebruikt om andere signaaltransducers te onderzoeken die zich op een vergelijkbare manier kunnen gedragen.Als er driver mutaties bij een kanker, dan is hun volledige remming niet nodig, omdat lage niveaus resterende daadwerkelijk zou leiden tot differentiatie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Synthese en karakterisering van een Aspirine-fumaraat Prodrug dat NFKB Activity and Breast Kanker stamcellen Remt

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Het modelleren van borstkanker via een Intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluatie van de differentiatie capaciteit van muizen prostaat epitheelcellen met behulp van Organoid cultuur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...