Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

La lignée cellulaire HC11 a été gentiment fournie par le Dr D. Medina (Houston, TX). Les auteurs sont reconnaissants au Dr Andrew Craig de l’Université Queen’s pour de nombreux réactifs et suggestions précieuses. Les cellules EpH4 étaient un cadeau du Dr C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick a fourni une excellente assistance technique pour les études de culture 3D.
L’aide financière du Conseil canadien de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG), des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), de la Fondation canadienne du cancer du sein (CBCF, section de l’Ontario), de l’Alliance canadienne de recherche sur le cancer du sein , les Centres d’excellence de l’Ontario, le Breast Cancer Action Kingston (BCAK) et le fonds de legs Clare Nelson par le biais de subventions à LR sont reconnaissants. BE a reçu un soutien de subvention des IRSC, de la FCCS, de la BCAK et de la Société de recherche sur le cancer inc. PTG est appuyé par une chaire de recherche du Canada, la Fondation canadienne pour l’innovation, les IRSC, le CRSR et la Société canadienne du cancer. MN a reçu l’appui d’un programme de formation Terry Fox en recherche transdisciplinaire sur le cancer de l’INCC, d’un prix d’études supérieures (QGA) et d’un prix du doyen de l’Université Queen’s. MG a reçu des bourses postdoctorales du Programme du cancer du sein de l’armée américaine, du ministère de la Recherche et de l’Innovation de la province de l’Ontario et du Comité consultatif de recherche de l’Université Queen’s. VH a reçu l’appui d’une bourse de doctorat de la FCCS et d’une bourse postdoctorale du Programme de formation de la Fondation Terry Fox en recherche transdisciplinaire sur le cancer, en partenariat avec les IRSC. Hanad Adan a reçu un stage d’été du CRSN. BS a reçu un prix d’études supérieures de l’Université Queen’s.

1. Placage des cellules HC11
<ol><li>Dans une hotte à débit laminaire utilisant des techniques stériles préparer une bouteille avec 50 ml de milieu cellulaire HC11: RPMI-1640 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 5 g/mL d’insuline, et 10 ng/mL EGF (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Assiette d’environ 400 000 cellules par plat Petri de 3 cm : Passez deux plats Petri de 10 cm et 50 % en confluents dans vingt plats de 3 cm en milieu HC11. Les cellules doivent être bien étalées, mais le s...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

Les cellules HC11 sont idéalement adaptées à l’étude de la différenciation en conjonction avec la transformation néoplastique. Un avantage supplémentaire est que les cellules HC11 sont facilement infectables avec des vecteurs rétroviraux à base de Mo-MLV pour exprimer une variété de gènes. Dans nos mains, les cellules EpH4 étaient plus difficiles à infecter avec les mêmes vecteurs rétroviraux que le HC112.
Le contact de cellule à cellule et l’arrêt...

Dans les tissus normaux ou les tumeurs, les cellules ont de vastes possibilités d’adhérence à leurs voisins dans une organisation tridimensionnelle, et cela est imité dans la culture par la croissance cellulaire de haute densité. L’adhérence de cellule à cellule est négociée principalement par des récepteurs de cadhérine, qui définissent l’architecture cellulaire et tissulaire. Fait intéressant, il a été récemment démontré que les cadhérines jouent également un rôle puissant dans la transduction du signal, en particulier dans la signalisation de survie1. Paradoxalement, certains de ces signaux d’adhérence cellulaire à cellule émanant de cadhérines se sont récemment avérés partagés à la fois par la différenciation et la néoplasie2. Ici, nous décrivons des méthodes d’induction et d’évaluation de la différenciation dans deux types représentatifs de lignées épithéliales de sein de souris, HC11 et EpH4.
La lignée épithéliale du sein de souris HC11 peut fournir un modèle utile pour l’étude de la différenciation épithéliale des cellules. Les cellules HC11 sont une lignée cellulaire dérivée de COMMA-1D, provenant de la glande mammaire d’une souris Balb/c mi-enceinte3. Contrairement à d’autres clones dérivés de COMMA-1D, le clone HC11 n’a pas besoin d’ajouter exogènement la matrice extracellulaire ou la cocultivation avec d’autres types de cellules pour l’induction in vitro du gène endogène de la casémine par les hormones lactogéniques3. Cette lignée cellulaire a été largement utilisée dans les études de différenciation parce qu’elle a conservé des caractéristiques importantes de l’épithélium mammaire normal : les cellules HC11 peuvent reconstituer partiellement l’épithélium canalaire dans un coussinet de graisse mammaire dédouané4. En outre, ils peuvent se différencier dans une culture bidimensionnelle (2D) lorsqu’ils sont cultivés à la confluence attachée à une surface de plat Petri en plastique en présence d’un stéroïde comme Hydrocortisone ou Dexamethasone, en plus de insulin et Prolactin (HIP moyen) dépourvu de facteur de croissance épidermique (EGF), un inhibiteur de la différenciation5,6,7. Dans ces conditions, les cellules HC11 produisent des protéines de lait telles que la caséine et le WAP, qui sont détectables par le ballonnement occidental dans les 4 jours suivant l’induction. Dans le même temps, une partie des cellules HC11 forme des structures rudimentaires ressemblant à des glandes mammaires appelées « dômes » d’une manière stochastique. Les dômes sont visibles 4 à 5 jours après l’induction et augmentent graduellement en taille jusqu’au jour 10, concomitant avec une augmentation de la production de caséine8. Fait intéressant, les cellules HC11 possèdent mutant p539, et représentent donc un état prénéoplastique. Pour cette raison, le modèle HC11 est idéal pour étudier les réseaux de signalisation de différenciation en conjonction avec la néoplasie dans le même système cellulaire.
Les cellules EpH4, un dérivé des cellules IM-2, sont une lignée cellulaire nontumorigenic dérivée à l’origine de cellules épithéliales de glande mammaire de souris spontanément immortalisées isolées d’une souris Mi-enceinte de Balb/c10. Les cellules EpH4 forment des monocouches épithéliales continues dans la culture 2D, mais ne se différencient pas en structures glandulaires10,11. Cependant, après la croissance 3D dans un matériau composé d’un mélange de protéines de matrice extracellulaire produites par les cellules de sarcome de souris EHS12 (matrice EHS, matrice, ou Matrigel, voir Tableau des matériaux), en plus de la stimulation avec HIP, les cellules EpH4 peuvent récapituler les étapes initiales de la différenciation des glandes mammaires. Dans ces conditions, les cellules EpH4 forment des sphéroïdes (également appelés mammosphères) qui présentent une polarité apical-basale et un lumen creux, et sont capables de produire les protéines du lait- caséine et WAP, semblables aux cellules épithéliales mammaires. Contrairement aux cellules HC11, qui sont indifférenciées, et certains marqueurs mésenchymal express13, epH4 cellules présentent une morphologie purement lumineuse14. Les cellules EpH4 ont également été rapportées pour produire des protéines de lait dans la culture 2D par la stimulation avec la dexaméthasone, l’insuline, et la prolactine15. Cependant, cette approche empêche l’étude des effets réglementaires qui imitent le microenvironnement de glande mammaire dans la culture 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Les cadhérines jouent un rôle important dans la régulation de la différenciation cellulaire ainsi que de la néoplasie. Nous décrivons ici les origines et les méthodes de l’induction de la différenciation de deux lignées épithéliales de sein de souris, HC11 et EpH4, et leur utilisation pour étudier des étapes complémentaires du développement de glande mammaire et de la transformation néoplastique.
La lignée épithéliale de cellules épithéliales de sein de souris de HC11 a provenu de la glande mammaire d’une souris enceinte de Balb/c. Il se différencie lorsqu’il est cultivé à la confluence attachée à une surface de plat Petri en plastique dans le milieu contenant le sérum foetal de veau et Hydrocortisone, insulin et Prolactin (hip medium). Dans ces conditions, les cellules HC11 produisent les protéines du lait et la protéine acide de lactosérum (WAP), semblables aux cellules épithéliales mammaires en lacactation, et forment des structures mammaires rudimentaires appelées « dômes ».
La lignée cellulaire EpH4 a été dérivée de cellules épithéliales de glande mammaire de souris spontanément immortalisées isolées d’une souris Enceinte de Balb/c. Contrairement à HC11, les cellules EpH4 peuvent se différencier entièrement en sphéroïdes (également appelés mammosphères) lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions de croissance tridimensionnelles (3D) dans le milieu HIP. Les cellules sont trypsinisées, suspendues dans une matrice de 20% composée d’un mélange de protéines de matrice extracellulaire produites par les cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), plaquées sur une couche de matrice concentrée recouvrant un plat Petri en plastique ou une plaque multiwell, et recouvertes d’une couche de 10% de milieu hip contenant une matrice de 10%. Dans ces conditions, les cellules EpH4 forment des sphéroïdes creux qui présentent une polarité apical-basale, un lumen creux, et produisent de la caséine et du WAP.
En utilisant ces techniques, nos résultats ont démontré que l’intensité du signal cadhérine/Rac est essentielle à la différenciation des cellules HC11. Alors que Rac1 est nécessaire pour la différenciation et de faibles niveaux de racV12 activé augmenter la différenciation, les niveaux élevés RacV12 bloquer la différenciation tout en induisant la néoplasie. En revanche, les cellules EpH4 représentent un stade précoce de la différenciation épithéliale mammaire, qui est inhibée par même de faibles niveaux de RacV12.

On sait depuis longtemps que la différenciation des cellules épithéliales et des adipocytes nécessite la confluence et l’engagement des cadhérines2. Nous et d’autres avons démontré que l’adhérence de cellule à cellule et l’engagement de E- ou N-cadherin et cadherin-11, comme cela se produit avec la confluence des cellules cultivées, déclenche une augmentation spectaculaire de l’activité de la petite protéine GTPases Rac et de contrôle de la division cellulaire 42 (Cdc42), e...

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Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Nous décrivons des techniques pour l’induction de différenciation de deux lignes épithéliales de sein, HC11 et EpH4. Tandis que les deux exigent le sérum foetal de veau, l’insuline, et la prolactine pour produire des protéines de lait, les cellules d’EpH4 peuvent entièrement différencier dans les mammospheres dans la culture tridimensionnelle. Ces modèles complémentaires sont utiles pour les études de transduction de signal de différenciation et de néoplasie.

Différenciation des cellules Epithéliales De l’épithélial de souris HC11 et EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Les cellules HC11 et EpH4 sont des lignées cellulaires épithéliales du sein de souris qui peuvent se différencier en culture. Dans le même temps, ces cellules peuvent être transformées par un certain nombre d’oncogènes. Ces cellules sont idéales pour l’étude de l’interrelation entre la différenciation et la transformation néoplastique.Ces techniques peuvent être utilisées dans des études de transduction de signaux pour découvrir des cibles pour la thérapie contre le cancer. Par exemple, la petite GTPase Rac et d’autres molécules peuvent déclencher la transformation des cellules épithéliales du sein lorsqu’elles sont exprimées à des niveaux élevés, mais étonnamment à de faibles niveaux, elles peuvent induire une différenciation. D’autres transducteurs de signaux peuvent se comporter de la même manière.Les principes peuvent également s’appliquer à d’autres types de différenciation lorsque la confluence cellulaire joue un rôle important, par exemple la différenciation des adipocytes ou des myotubes. Quelqu’un exécutant cette technique pour la première fois devrait garder à l’esprit que le placage des cellules HC11 est important. C’est parce que le contact cellule-cellule est important pour la différenciation.Un autre point à surveiller est que l’extraction correcte des cellules EpH4 de la matrice est essentielle pour la quantitation des protéines, car tous les résidus affecteront la détermination des protéines. La démonstration visuelle de cette méthode est utile parce que certains détails du protocole sont difficiles à décrire sur papier. Commencez par préparer une bouteille de 50 millilitres de milieu cellulaire HC11 selon les directives manuscrites.Pour plaquer les cellules, aspirer le milieu de cinq plats Petri de six centimètres 50% confluents et laver les cellules avec environ 1,8 millilitres de trypsine à l’aide d’une pipette pasteur stérile de neuf pouces en coton branché. Ajouter ensuite 200 microlitres de trypsine par plaque et faire tourbillonner la plaque pour déloger les cellules attachées. Observez les cellules sous microscopie de contraste de phase avec un objectif 4X pour s’assurer qu’elles ont commencé à déloger.Ensuite, aspirez environ 1,5 millilitres de HC11 moyen avec une pipette pasteur stérile de neuf pouces et gicler verticalement contre les cellules tout en tournant le plat en s’assurant d’éviter les éclaboussures. Transférer toutes les cellules dans la bouteille avec HC11 moyen et tourbillonner pour se disperser uniformément dans la bouteille. Puis aliquot la suspension cellulaire en 20 boîtes de Pétri de trois centimètres par pipetting deux millilitres de cellules par plat.Rock les boîtes de Petri pour répandre les cellules et les incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, lorsque les cellules sont 90 à 100% confluent, aspirer le milieu et le remplacer par moyen par FBS, mais sans FEM. Après avoir fait pousser les cellules à moyen sans FEM pendant 24 heures, ajouter le milieu de différenciation à 10 plats et faire pousser les cellules jusqu’à 10 jours en gardant les 10 autres plats comme témoins.Changez le milieu tous les deux à trois jours avec les cellules traitées hip et de contrôle. Pour surveiller la différenciation, observez les cellules avec la microscopie de contraste de phase. Utilisez la microscopie par fluorescence si les cellules expriment des protéines fluorescentes vertes.En outre, quantifier le degré de différenciation en extrayant des protéines des cellules traitées et de contrôle hip une fois par jour et en effectuant l’analyse western blot. Rassemblez et placez le milieu de croissance EpH4, la matrice EHS et deux tubes coniques de 50 millilitres sur la glace. Préchill les plaques de culture tissulaire avec des pointes pipette à moins 20 degrés Celsius et de préparer eph4 milieu de croissance complété par 10 ou 20% matrice en deux tubes coniques de 50 millilitres et les garder sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à utiliser.Après avoir récupéré les plaques de culture tissulaire préchilées à moins 20 degrés Celsius, enduire 10 puits de la plaque de 24 puits de 150 microlitres de matrice non diluée en étalant la matrice à l’aide d’une pipette. Évitez de créer des bulles lors de la propagation de la matrice. Puis appuyez doucement sur les côtés de la plaque et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre à la matrice de se solidifier.Pendant ce temps, préparez-vous à la différenciation en trypsinisant les cellules EpH4 ainsi que précédemment décrit et en assurant des suspensions cellulaires simples après la résuspension des cellules trypsinisées. Ensuite, comptez les cellules en suspension à l’amiomètre. Transférer cinq fois 10 dans les quatre cellules par puits dans un tube de centrifugeuse conique stérile de 1,5 millilitre et les faire tourner à 250 fois g pendant cinq minutes.Aspirez soigneusement le milieu supernatant et placez le tube sur la glace. Utilisez une pointe de pipette d’un millilitre pour résuspendre les cellules dans 350 microlitres de milieu de croissance EpH4 complété par une matrice de 20%, tout en gardant les tubes sur la glace en s’assurant d’éviter les bulles. Une fois que la couche inférieure s’est solidifiée, ajoutez les 350 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits enduit et placez-le dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre à la couche matricielle de 20 % de se solidifier.Observez les cellules avec la microscopie de contraste de phase pour s’assurer que les cellules simples sont visibles. Ajouter ensuite 200 microlitres de milieu EpH4 avec 10% de matrice sur le dessus et incuber la plaque à 37 degrés Celsius. Commencez l’induction de différenciation un jour après le placage des cellules dans la matrice.Retirez soigneusement 150 microlitres du milieu matriciel supérieur de 10 % et ajoutez 200 microlitres de milieu EpH4 contenant hip et 10% matrice et pour les contrôles ajouter un milieu matricielle de 10% sans HIP. Remplacer le milieu tous les deux jours jusqu’à 10 jours en surveillant la formation de mammosphère par une microscopie à contraste de phase. Pour quantifier la différenciation, pipette soigneusement le milieu HIP 10% matrice des puits et rincer la couche matricielle de 20% avec 350 microlitres de PBS glacé.Ajouter ensuite 70 à 100 microlitres de PBS glacé avec un millimolaire EDTA directement dans les puits et détacher doucement la couche inférieure de la matrice à 100 % avec une pointe de pipette. Agiter doucement l’assiette à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Transférer délicatement la suspension sphéroïde dans un tube conique et rincer les puits avec 500 microlitres de PBS EDTA pour récupérer les sphéroïdes restants.Rock le tube sur la glace pendant 30 minutes supplémentaires en s’assurant que la matrice se dissout complètement. Si des touffes matricielles visibles sont vues, ajoutez plus de PBS EDTA ou secouez plus longtemps. Centrifugeuse de la solution à 350 fois g pour pelleter les sphéroïdes.Puis aspirer le supernatant, lyse les sphéroïdes, et sonder les cellules pour la bêta-caséine, cycline D1, et p120RasGAP par ballonnement occidental. Il existe une dépendance frappante de différenciation sur la force du signal Rac dans les cellules HC11. Alors que le CRAC1 endogène est nécessaire pour la différenciation et de faibles niveaux de RacV12 activé par mutation provoquent une augmentation de la capacité de différenciation, des niveaux élevés de RacV12 déclenchent un bloc de différenciation et induisent la néoplasie.Quand les propriétés de différenciation des cellules d’EpH4 ont été explorées dans une culture de matrice 3D, il a été constaté que la production de bêta-caséine a culminé à huit à 10 jours et l’expression de cyclin D1 était maximale à quatre à six jours après stimulation de HIP. Pour déterminer le positionnement des cellules individuelles, elles ont été tachées de DAPI et photographiées avec une microscopie confoccale. La mort interne de cellules et la formation des lumens creux ont été observées dans les mammosphères tandis que l’addition de HGF a eu comme conséquence la formation des structures tubulaires.Quelqu’un effectuant cette technique pour la première fois doit garder à l’esprit que le placage des cellules HC11 est important. Une extraction correcte des cellules EpH4 de la matrice est également essentielle à la quantitation des protéines, car tout résidu affectera la détermination des protéines. Cette technique peut être utilisée pour étudier d’autres transducteurs de signaux qui peuvent se comporter de la même manière.S’il y a des mutations de conducteur dans un cancer, alors leur inhibition complète ne sera pas nécessaire puisque de bas niveaux restants induisent réellement la différenciation.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Synthèse et caractérisation d&#39;un promédicament Aspirin-fumarate qui inhibe l&#39;activité de NFkB et du sein des cellules souches du cancer

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Comportement invasif des cellules cancéreuses du sein humain dans Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Vivre-imagerie de la Migration des cellules épithéliales mammaires après la diminution transitoire des TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopique l’Injection de cellules cancéreuses du sein dans les coussinets adipeux mammaire de souris

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modélisation du cancer du sein par injection intraductale d'adénovirus exprimant la cre dans la glande mammaire de souris

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Évaluer la capacité de différenciation des cellules épithéliales de la prostate de la souris à l'aide de la culture organoïde

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Transplantation orthotopique de tumeurs mammaires comme modèles précliniques pour le cancer du sein

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Évaluation in vitro de la transformation oncogène des cellules épithéliales mammaires humaines

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Étude de la signalisation TGF-β et de la transition épithéliale à mésenchymale induite par le TGF-β dans le cancer du sein et les cellules normales

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...