Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

קו התא HC11 המסופק באדיבות ד ר ד. מדינה (יוסטון, TX). המחברים אסירי תודה ד ר אנדרו קרייג מאוניברסיטת המלכה עבור הצעות רבות של ריאגנטים ובעלי ערך. תאי EpH4 היו מתנה מדר ' ר. רוסקללי (ונקובר). קולין Schick סיפק סיוע טכני מעולה ללימודי תרבות תלת-ממדית.
הסיוע הכספי של מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC), המכונים הקנדיים של מחקר הבריאות (CIHR), הקרן הקנדית לסרטן השד (CBCF, אונטריו פרק), סרטן השד הקנדי הברית המחקר , מרכזי אונטריו של מצוינות, סרטן השד פעולה קינגסטון (BCAK) ואת הקרן קלייר נלסון עיזבון באמצעות מענקים LR הוא הודה בהכרת. להיות מקבל תמיכה מענקים CIHR, CBCF, BCAK האגודה לחקר הסרטן Inc. PTG נתמך על ידי יו ר מחקר קנדה, הקרן הקנדית לחדשנות, CIHR, NSERC והחברה הקנדית הסרטן. MN נתמך על ידי הספינה מתוך תוכנית ההכשרה טרי פוקס במחקר טרנסמשמעתי סרטן מ-NCIC, בוגר פרס (QGA), ופרס של דיקן מאוניברסיטת המלכה. ה-MG נתמך על ידי מלגות דוקטורט מתוכנית סרטן השד בארה ב, משרד המחקר והחדשנות של מחוז אונטריו וועדת המחקר המייעצת של אוניברסיטת המלכה. VH נתמך על ידי מלגת דוקטורט של CBCF ומלגת דוקטורט מתוכנית ההכשרה של קרן טרי פוקס בחקר הסרטן הטרנסמשמעתי בשותפות עם CIHR. Hanad אדן היה המקבל של הקיץ NSERC הסירה. BS הייתה נתמכת בתואר בוגר אוניברסיטת המלכה.

1. ציפוי תאים HC11
<ol><li>במכסה של זרם למינארי באמצעות טכניקות סטרילי להכין בקבוק עם 50 mL של HC11 cell בינונית: RPMI-1640 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 5 μg/mL אינסולין, ו 10 ng/mL EGF (ראה לוח חומרים).</li>
	<li>צלחת כ 400,000 תאים לכל 3 ס מ צלחת פטרי: לעבור 2 10 ס"מ, 50% confluent מנות פטרי לתוך עשרים 3 ס"מ מנות במדיום HC11. את התאים ...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

התאים הHC11 מתאימים באופן אידיאלי לחקר הבידול בשילוב עם טרנספורמציה נאופלסטית. יתרון נוסף הוא כי תאים HC11 הם בקלות infectable עם מו-MLV מבוססי וקטורים retroviral יעיל לבטא מגוון של גנים. בידינו, תאים EpH4 היו קשים יותר להדביק עם אותו וקטורים retroviral יעיל מאשר HC112.
מגע מתאים לתאים ו...

ברקמות רגילות או גידולים, לתאים יש הזדמנויות נרחבות הדבקה לשכניהם בארגון תלת מימדי, וזה מחקה בתרבות על ידי צמיחת תאים בצפיפות גבוהה. הדבקה תא לתא מתווכת בעיקר באמצעות קולטני קדהרין, המגדירים את ארכיטקטורת התאים והרקמה. מעניין, זה הוכיח לאחרונה כי cadherins גם לשחק תפקיד רב עוצמה התמרה האות, במיוחד הישרדות איתות1. אופן פרדוקסאלי, חלק האותות האלה תא לתא הדבקה הנובע cadherins נמצאו לאחרונה להיות משותפים על ידי בידול וגם neoplasia2. כאן, אנו מתארים שיטות של אינדוקציה והערכה של בידול שני סוגים של הנציג של שד העכבר האפיתל קווים, HC11 ו EpH4.
שד HC11 העכבר האפיתל קו התאים יכול לספק מודל שימושי למחקר של בידול התא אפיתל. תאי HC11 הם קו שנגזר באמצעות פסיקים-1D, שמקורם בבלוטת החלב של עכבר באמצע ההיריון בגודל Balb/c3. בניגוד אחרים פסיקים-1D שיבוטים נגזרים, HC11 שיבוט אין דרישה לשימוש באופן אקסוגנטי מטריצה מוסף או טיפוח עם סוגי תאים אחרים עבור האינדוקציה מחוץ לשני של הגן האנדוגניים β-קזאין על ידי הורמונים lactogenic3. קו תא זה נעשה שימוש נרחב במחקרים בידול כי הוא שמרו מאפיינים חשובים של אפיתל הפטמות נורמלי: HC11 תאים יכול באופן חלקי ליצור מחדש את האפיתל ductal בתוך משטח שומן החלב העבה4. יתר על כן, הם יכולים להבדיל בתרבות דו-ממדית (2d) כאשר גדל למפגש המצורפת משטח צלחת פטרי פלסטיק בנוכחות של סטרואידים כגון Hydrocortisone או דקאמתאסone, בנוסף אניnsulin ו Prolactin (היפ בינוני) חסר גורם גידול עוריות (egf), מעכב של בידול5,6,7. בתנאים אלה, תאי HC11 לייצר חלבונים חלב כגון β-קזאין ו-WAP, אשר מ על ידי בלוק המערבי בתוך 4 ימים לאחר האינדוקציה. באותו זמן, חלק של תאים HC11 צורות בלוטת הפטמות בצורת בלוטה הנקרא "כיפות" באופן סטוכסטי. כיפות גלויות 4 – 5 ימים לאחר האינדוקציה ולהגדיל בהדרגה בגודל של עד היום 10, במקביל עם גידול בייצור β-קזאין8. מעניין, HC11 תאים בעלי מוטציה p539, ולכן מייצגים מדינה preneoplastic. מסיבה זו, המודל HC11 מתאים באופן אידיאלי כדי לחקור רשתות איתות של בידול בשילוב עם neoplasia באותה מערכת התא.
EpH4 תאים, נגזרת של התאים IM-2, הם קו תא התאים המקורי נגזר במקור באופן ספונטני בלוטת החלב העכבר תאים אפיתל בודד מ באמצע בהריון Balb/c העכבר10. תאים EpH4 טופס אפיתל מונאולאיירס בתרבות 2D, אבל לא להבדיל לתוךמבנים כמו בלוטות 10,11. עם זאת, בעקבות צמיחה תלת-ממדית בחומר המורכב מתערובת של חלבונים מטריצות של מטריקס המיוצר על ידי תאים EHS העכבר סרקומה12 (EHS מטריקס, מטריקס, או מטריצות, ראה טבלה של חומרים), בנוסף גירוי עם היפ, EpH4 תאים יכול ללכוד את השלבים הראשוניים של בלוטת החלב בידול. בתנאים אלה, תאי הEpH4 היוצרים בצורת הספרואידים (המכונים גם ממוגרפיה) המוצגים קוטביות-בסיס ולומן חלול, ומסוגלים לייצר את חלבוני החלב הβ-קזאין ו-WAP, בדומה לתאי האפיתל מניקות. בניגוד HC11 תאים, אשר מובחן, וכמה סמנים mesenchymal מהיר13, תאים EpH4 להציג מורפולוגיה גרידא הלומיאל14. תאים EpH4 גם דיווחו לייצר חלבונים חלב בתרבות דו-ממדית באמצעות גירוי עם דקאמתאס1, אינסולין, ו פרולקטין15. עם זאת, גישה זו מונע את המחקר של השפעות רגולטוריות המחקים את מיקרואקולוגיה של בלוטת החלב בתרבות תלת-ממדית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

קדהרנס ממלאים תפקיד חשוב בוויסות בידול התא וכן בneoplasia. כאן אנו מתארים את המקורות ואת השיטות של אינדוקציה של הבידול של שני העכבר שורות האפיתל התאים, HC11 ו EpH4, ואת השימוש שלהם ללמוד בשלבים משלימים של התפתחות בלוטת החלב וטרנספורמציה נאופלסטית.
שד HC11 העכבר קו האפיתל מקורו בלוטת החלב של עכבר Balb/c בהריון. זה מבדיל כאשר גדל למפגש מחובר משטח צלחת פטרי פלסטיק בינוני המכיל סרום עגל עוברי ו- Hydrocortisone, אניNsulin ו PROLACTIN (מדיום היפ). בתנאים אלה, תאי HC11 לייצר את החלבונים בחלב β-קזאין, חלבון חומצי מי גבינה (WAP), בדומה לתאי הנקה המניקה התאים, וצורות בלוטת החלב בצורת בלוטה הנקרא "כיפות".
קו התא EpH4 נגזר באופן ספונטני בלוטת החלב של העכבר תאים אפיתל מבודדים מעכבר Balb/c בהריון. שלא כמו HC11, תאים EpH4 יכולים להבדיל באופן מלא לתוך spheroids (המכונה גם ממוגרפיה) כאשר התרבות תחת תלת מימדי (3D) תנאי גדילה במדיום HIP. תאים הם טריסינטזציה, התלויה ב 20% מטריצה המורכבת מתערובת של חלבונים מטריצות של מטריקס המיוצר על ידי אנגלברב-הולם-נחיל (EHS) עכבר בתאי סרקומה, מצופה על גבי שכבה של ציפוי מטריצה מרוכזת צלחת פטרי או צלחת multiwell יטב, מכוסה בשכבה של 10% מטריקס מכיל מדיום הירך. בתנאים אלה, תאי EpH4 מהווים מספרואידים חלולים המוצגים קוטביות-בסיס, לומן חלול, ומייצרים β-קזאין ו-WAP.
באמצעות טכניקות אלו, התוצאות שלנו הראו כי עוצמת האות של קדהרין/מירוץ היא קריטית עבור הבידול של תאים HC11. בעוד Rac1 הוא הכרחי עבור בידול ורמות נמוכות של מירוץ המופעלרובוטית v12 להגדיל את הבידול, מירוץ גבוהרובוטית v12 רמות לחסום בידול תוך גרימת neoplasia. לעומת זאת, תאי EpH4 מייצגים שלב מוקדם יותר בידול האפיתל הפטמות, אשר מעוכב על ידי רמות נמוכות אפילו שלמרובוטית v12מירוץ.

זה זמן רב ידוע כי הבידול של תאים אפיתל ו adipocytes דורש המפגש וההתחייבות של קדהרנים2. אנחנו ואחרים הדגמנו שההזיה הסלולרית והאירוסין של E-או N-קדהרין ו קדהרין-11, כפי שהוא מתרחש עם המפגש של תאים מתורבתים, מפעיל עלייה דרמטית בפעילות של מירוץ הקטן gtpases וחילוק התא בקרת חלבון 42 (Cdc42), ותהליך ...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

אנו מתארים טכניקות לבידול אינדוקציה של שני קווי אפיתל השד, HC11 ו EpH4. בעוד ששניהם דורשים סרום עגל עוברי, אינסולין, ו פרולקטין לייצר חלבונים חלב, EpH4 תאים יכולים להבדיל באופן מלא לתוך ממוגרפיה בתרבות תלת ממדית. המודלים המשלימים הללו שימושיים למחקרים של הneoplasia בידול ומדידה.

הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

התאים HC11 ו- EpH4 הם קווי תא אפיתל השד העכבר אשר יכול להבדיל בתרבות. במקביל, תאים אלה יכולים להשתנות על ידי מספר אונקוגנים. תאים אלה הם אידיאליים לחקר יחסי הגומלין בין בידול לבין טרנספורמציה ניאופלסטית.טכניקות אלה ניתן להשתמש במחקרים התמרת אותות כדי לגלות מטרות לטיפול בסרטן. לדוגמה, GTPase Rac קטן ומולקולות אחרות עלול לעורר טרנספורמציה של תאי אפיתל השד כאשר לידי ביטוי לרמות גבוהות, אבל באופן מפתיע ברמות נמוכות, הם עלולים לגרום בידול. מתמרים אותות אחרים עשויים להתנהג באופן דומה.העקרונות עשויים לחול על סוגים אחרים של התמברות, כמו גם כאשר ההתכנסות התא ממלא תפקיד חשוב, למשל ההידול של adipocytes או myotubes. מישהו המבצע טכניקה זו בפעם הראשונה צריך לזכור כי ציפוי של תאי HC11 חשוב. הסיבה לכך היא ש איש קשר בין תא לתא חשוב להתביור.נקודה נוספת שיש להיזהר ממנה היא כי מיצוי נאות של תאי EpH4 מהמטריצה הוא קריטי לכמות חלבונים מכיוון שכל שאריות ישפיעו על קביעת החלבון. הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שקשה לתאר פרטים מסוימים של הפרוטוקול על הנייר. התחל על ידי הכנת בקבוק של 50 מיליליטר של תא HC11 בינוני על פי הוראות כתב היד.כדי צלחת התאים, שאפו את המדיום מחמישה שישה סנטימטרים 50% מנות פטרי confluent ולשטוף את התאים עם כ 1.8 מיליליטר של טריפסין באמצעות פיפטה פסטר סטרילי תשעה אינץ 'כותנה מחוברת פסטר. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטרים של טריפסין לכל צלחת ומערבבים את הצלחת כדי לנתק את התאים המחוברים. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם מטרה 4X כדי לוודא שהם התחילו לסלק.לאחר מכן שאפו כ-1.5 מיליליטר של מדיום HC11 עם פיפט פסטר סטרילי בגודל 9 אינץ' והתיזו אותו אנכית על התאים תוך כדי סיבוב המנה כדי להימנע מהתזה. מעבירים את כל התאים לבקבוק עם מדיום HC11 ומערבבים להתפזר באופן שווה בבקבוק. ואז aliquot ההשעיה התא לתוך 20 שלוש ס"מ פטרי מנות על ידי pipetting שני מיליליטר של תאים לכל מנה.רוק מנות פטרי כדי להפיץ את התאים דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לילה. ביום שלמחר, כאשר התאים הם 90 עד 100%confluent, שאפו את המדיום והחליפו אותו במדיום ב- FBS אך ללא EGF. לאחר גידול התאים במדיום ללא EGF במשך 24 שעות, מוסיפים את מדיום ההידול ל -10 מנות ומגדלים את התאים עד 10 ימים ושומרים על 10 הכלים האחרים כפקדים.שנה את המדיום כל יומיים עד שלושה עם תאי שליטה ומטופלים על-ידי HIP. כדי לפקח על ההידול, התבונן בתאים עם מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטי אם התאים מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק.בנוסף, לכמת את מידת ההתברות על ידי חילוץ חלבונים מן HIP שטופלו ולשלוט בתאים פעם ביום וביצוע ניתוח כתם מערבי. אסוף והצב את מדיום הצמיחה EpH4, מטריצת EHS, ושני צינורות חרוטיים 50 מיליליטר על קרח. Prechill צלחות תרבות הרקמה עם טיפים פיפטה במינוס 20 מעלות צלזיוס ולהכין EpH4 צמיחה בינוני בתוספת 10 או 20% מטריצה בשני צינורות חרוט 50 מיליליטר ולשמור אותם על קרח עד מוכן לשימוש.לאחר אחזור צלחות תרבות הרקמה prechilled במינוס 20 מעלות צלזיוס, מעיל 10 בארות של צלחת 24 באר עם 150 microliters של מטריצה לא מבודדת על ידי הפצת המטריצה עם פיפסה. הימנע מיצירת בועות בעת הפצת המטריצה. לאחר מכן הקישו בעדינות על דפנות הצלחת והדגירה את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר למטריצה להתגבש.בינתיים, להתכונן ההידול על ידי טריפסיה של תאי EpH4, כמו גם שתואר בעבר והבטחת מתלים תא יחיד לאחר שימוש חוזר של תאים טריפסיניים. לאחר מכן, לספור את התאים בהשעיה עם המוציטומטר. מעבירים חמש פעמים 10 לארבעת התאים ל באר לצינור צנטריפוגה חרוט סטרילי 1.5 מיליליטר ולסובב אותם ב 250 פעמים g במשך חמש דקות.בזהירות שאף את המדיום העל-טבעי והצב את הצינור על הקרח. השתמשו בקצה פיפיטה של מיליליטר אחד כדי לנצל מחדש את התאים ב-350 מיקרוליטרים של מדיום הצמיחה EpH4 בתוספת מטריצה של 20%, תוך שמירה על הצינורות על הקרח כדי למנוע בועות. לאחר שהשכבה התחתונה התגבשה, הוסיפו את 350 המיקרוליטרים של מתלי התאים לכל היטב מצופה והצבו אותה בממגר פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר לשכבת המטריצה של 20% להתגבש.שימו לב לתאים עם מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לוודא שתאים בודדים גלויים. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום EpH4 עם 10% מטריצה למעלה והדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס. התחל אינדוקציה ההידול יום אחד לאחר ציפוי התאים במטריצה.הסר בזהירות 150 מיקרוליטרים של מדיום מטריצה 10%matrix העליון ולהוסיף 200 microliters של אמצעי EpH4 המכיל HIP ו 10% מטריצה עבור פקדים להוסיף מדיום מטריצה 10% ללא HIP. החלף את המדיום כל יומיים עד 10 ימים ניטור היווצרות mammosphere עם מיקרוסקופ ניגוד פאזה. כדי לכמת את ההידול, בזהירות pipette את 10%מטריצה HIP בינוני מן הבארים ולשטוף את שכבת מטריצה 20% עם 350 microliters של קרח קר PBS.לאחר מכן הוסיפו 70 עד 100 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח עם EDTA מילימולר אחד ישירות לתוך בארות וניתקים בעדינות את השכבה התחתונה של מטריצה של 100% עם קצה פיפטה. מנערים את הצלחת בעדינות בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בזהירות להעביר את ההשעיה spheroid לצינור חרוט ולשטוף את הבארים עם 500 microliters של PBS EDTA כדי לשחזר את כל כדוריות שנותרו.רוק הצינור על קרח במשך 30 דקות נוספות לוודא כי המטריצה מתמוססת לחלוטין. אם ניתן לראות גושי מטריצה גלויים, הוסיפו עוד PBS EDTA או רעד זמן רב יותר. צנטריפוגה הפתרון ב 350 פעמים g כדי גלולה כדוריים.לאחר מכן שאפו את העל-טבעי, תנו את הכדורים, וגלו את התאים עבור בטא-קסטין, ציקלין D1 ו-p120RasGAP על-ידי כתמים מערביים. יש תלות בולטת של התברואה על כוחו של אות Rac בתאי HC11. בעוד CRAC1 אנדוגני נדרש עבור בידול ורמות נמוכות של RacV12 מופעל מוטציה לגרום לעלייה בקיבולת בידול, רמות גבוהות RacV12 לעורר בלוק של בידול ולגרום neoplasia.כאשר תכונות ההבחנה של תאי EpH4 נחקרו בתרבות מטריצה תלת-מימדית, נמצא כי ייצור בטא-קסטין הגיע לשיא של 8 עד 10 ימים וביטוי מחזור D1 היה מקסימלי בארבעה עד שישה ימים לאחר גירוי HIP. כדי לקבוע את המיקום של תאים בודדים, הם היו מוכתמים ב- DAPI ומדמים אותם במיקרוסקופיה קונפוקאלית. מוות תאי פנימי היווצרות של לומן חלול נצפתה mammospheres בעוד תוספת של HGF הביא להיווצרות של מבנים צינוריים.מישהו מבצע טכניקה זו בפעם הראשונה צריך לזכור כי ציפוי של תאי HC11 חשוב. גם מיצוי נאות של תאי EpH4 מהמטריצה הוא קריטי עבור כימות חלבון כי כל שאריות ישפיעו על קביעת החלבון. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור מתמרים אות אחרים שעלולים להתנהג באופן דומה.אם יש מוטציות הנהג בסרטן, אז העיכוב המלא שלהם לא יהיה צורך מאז רמות נמוכות שנותרו למעשה לגרום התביור.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

סינתזה ואפיון של prodrug אספירין-fumarate המעכבת תאי גזע סרטניים פעילות השד NFκB

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

הדמיה חיה של נדידת תאים אפיתל השד לאחר דלדול ארעית של TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

הזרקת Orthotopic של תאים סרטניים בשד אל תוך כרית שומן החלב עכברים

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

דוגמנות סרטן השד באמצעות הזרקת הפנים של המין-אדנווירוס המבטא לתוך בלוטת החלב של העכבר

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...