Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

La linea cellulare HC11 è stata gentilmente fornita dal Dr. D. Medina (Houston, TX). Gli autori sono grati al Dr. Andrew Craig della Queen's University per molti reagenti e preziosi suggerimenti. Le cellule EpH4 sono state un dono del Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ha fornito un'eccellente assistenza tecnica per gli studi di cultura 3D.
L'assistenza finanziaria del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), dei Canadian Institutes of Health Research (CIHR), della Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), della Canadian Breast Cancer Research Alliance , i Centri di Eccellenza dell'Ontario, il Breast Cancer Action Kingston (BCAK) e il fondo di lascile Clare Nelson attraverso sovvenzioni a LR sono riconosciuti con gratitudine. BE ha ricevuto il sostegno da CIHR, CBCF, BCAK e Cancer Research Society Inc. PTG è supportato da un presidente di ricerca canadese, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC e Canadian Cancer Society. MN è stato supportato da una nave da uno studente del Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research di NCIC, un Graduate Award (QGA) e un Dean's Award della Queen's University. MG è stata sostenuta da borse di studio post-dottorato del Programma per il cancro al seno dell'esercito degli Stati Uniti, del Ministero della Ricerca e dell'Innovazione della Provincia dell'Ontario e del Comitato consultivo di ricerca della Queen's University. VH è stata sostenuta da una borsa di dottorato CBCF e da una borsa di studio post-dottorato del Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research in collaborazione con CIHR. Hanad Adan è stato il destinatario di uno studio estivo NSERC. LA BS è stata sostenuta da un premio di laurea della Queen's University.

1. Placcatura delle cellule HC11
<ol><li>In una cappa a flusso laminare utilizzando tecniche sterili preparare una bottiglia con 50 mL di HC11 mezzo cellulare: RPMI-1640 con 10% siero bovino fetale (FBS), 5 insulina g/mL, e 10 ng/mL EGF (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Piatto di circa 400.000 cellule per piatto Petri da 3 cm: Passare due piatti Petri 10 cm, 50% confluenti in venti piatti 3 cm in mezzo HC11. Le cellule devono essere ben distribuite, ma l'essiccazione deve essere evitata.<ol>
<li>...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

Le cellule HC11 sono ideali per lo studio della differenziazione in combinazione con la trasformazione neoplastica. Un ulteriore vantaggio è che le cellule HC11 sono facilmente infettivabili con vettori retrovirali basati su Mo-MLV per esprimere una varietà di geni. Nelle nostre mani, le cellule EpH4 erano più difficili da infettare con gli stessi vettori retrovirali di HC112.
Il contatto tra celle e l'arresto della crescita sono i prerequisiti fondamentali per la di...

Nei tessuti normali o tumori, le cellule hanno ampie opportunità di adesione ai loro vicini in un'organizzazione tridimensionale, e questo è imitato nella coltura dalla crescita cellulare ad alta densità. L'adesione da cellula a cellula è mediata principalmente attraverso i recettori della cadherin, che definiscono l'architettura cellulare e tissutale. È interessante notare che è stato recentemente dimostrato che le cadherine svolgono anche un ruolo potente nella trasduzione del segnale, specialmente nella segnalazione di sopravvivenza1. Paradossalmente, alcuni di questi segnali di adesione da cellula a cellula provenienti da cadherins sono stati recentemente trovati per essere condivisi sia dalla differenziazione che dalla neoplasia2. Qui, descriviamo i metodi di induzione e valutazione della differenziazione in due tipi rappresentativi di linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 e EpH4.
La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 può fornire un modello utile per lo studio della differenziazione delle cellule epiteliali. Le cellule HC11 sono una linea cellulare derivata da COMMA-1D, proveniente dalla ghiandola mammaria di un topo Balb/c a metà gravidanza3. A differenza di altri cloni derivati COMMA-1D, il clone hC11 non ha alcun requisito per la matrice extracellulare aggiunta esogenao o la cocoltivazione con altri tipi di cellule per l'induzione in vitro del gene endogeno della caseina endogena dagli ormoni lattogenici3 . Questa linea cellulare è stata ampiamente utilizzata negli studi di differenziazione perché ha mantenuto importanti caratteristiche del normale epitelio mammario: le cellule HC11 possono parzialmente ricostituire l'epitelio duttale in un cuscinetto di grasso mammario eliminato4. Inoltre, possono differenziarsi in una coltura bidimensionale (2D) quando coltivati alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto di Petri di plastica in presenza di uno steroide come Hydrocortisone o Dexamethasone, oltre a Insulin e Prolactin (media HIP) privo di fattore di crescita epidermica (EGF), un inibitore della differenziazione5,6,7. In queste condizioni, le cellule HC11 producono proteine del latte come la caseina e la WAP, che sono rilevabili dalla gonfiore occidentale entro 4 giorni dall'induzione. Allo stesso tempo, una porzione di cellule HC11 forma strutture rudimentali simili alla ghiandola mammaria definite "cupole" in modo stocastico. Le cupole sono visibili 4-5 giorni dopo l'induzione e aumentano gradualmente di dimensioni fino al giorno 10, concomitanti con un aumento della produzione di banofaz 8. È interessante notare che le cellule HC11 possiedono p539mutanti e quindi rappresentano uno stato preneoplastico. Per questo motivo, il modello HC11 è ideale per studiare le reti di segnalazione di differenziazione in combinazione con la neoplasia nello stesso sistema cellulare.
Le cellule EpH4, un derivato delle cellule IM-2, sono una linea cellulare non tumorale originariamente derivata da cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo immortalate spontaneamente isolate da un topo balb/c medio-gravidanza10. Le cellule EpH4 formano monostrati epiteliali continui in coltura 2D, ma non si differenziano in strutture simili alla ghiandaia10,11. Tuttavia, a seguito della crescita 3D in un materiale costituito da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte dalle cellule sarcoma del topo EHS12 (matrice EHS, matrice o Matrigel, vedi Tabella dei materiali), oltre alla stimolazione con HIP, le cellule EpH4 possono ricapitolare le fasi iniziali della differenziazione della ghiandola mammaria. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi (chiamati anche mammosferie) che presentano polarità apicale-basale e un lume cavo, e sono in grado di produrre le proteine del latte, la caseina e la WAP, simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano. Contrariamente alle cellule HC11, che sono indifferenziate, e alcuni esprimono marcatori mesenchymal13, cellule EpH4 mostrano una morfologia puramente luminale14. Cellule EpH4 sono stati segnalati anche per produrre proteine del latte nella coltura 2D attraverso la stimolazione con dexamethasone, insulina, e prolattina15. Tuttavia, questo approccio preclude lo studio degli effetti normativi che imitano il microambiente della ghiandola mammaria nella coltura 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

I cadherin svolgano un ruolo importante nella regolazione della differenziazione cellulare e della neoplasia. Qui descriviamo le origini e i metodi dell'induzione della differenziazione di due linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 ed EpH4, e il loro uso per studiare fasi complementari dello sviluppo della ghiandola mammaria e della trasformazione neoplastica.
La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 ha avuto origine dalla ghiandola mammaria di un topo balb/c incinta. Si differenzia quando viene coltivato alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto Petri di plastica in un mezzo contenente siero di vitello fetale e Hydrocortisone, Insulin e Prolactin (medium HIP). In queste condizioni, le cellule HC11 producono le proteine del latte proteina acida (WAP), simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano, e formano rudimentali strutture simili a ghiandole mammarie definite "cupole".
La linea cellulare EpH4 è stata derivata da cellule epiteliali mammarie topoimmortalizzate spontaneamente isolate da un topo balb/c incinta. A differenza dell'HC11, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in sferoidi (chiamati anche mammosferie) quando coltivate in condizioni di crescita tridimensionali (3D) nel mezzo HIP. Le cellule sono ortopsinizzate, sospese in una matrice del 20% costituita da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte da cellule di sarcoma tono Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), placcate sopra uno strato di matrice concentrata che riveste una piastra Petri di plastica o piastra multiwell, e coperte da uno strato di mezzo HIP composto da matrice del 10%. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi cavi che presentano polarità apicale-basale, un lume cavo, e producono la caseina e la WAP.
Utilizzando queste tecniche, i nostri risultati hanno dimostrato che l'intensità del segnale cadherin/Rac è fondamentale per la differenziazione delle cellule HC11. Mentre Rac1 è necessario per la differenziazione e bassi livelli di Attivato RacV12 aumentare la differenziazione, alti livelli di RacV12 bloccano la differenziazione mentre inducono neoplasia. Al contrario, le cellule EpH4 rappresentano una fase precedente nella differenziazione epiteliale mammaria, che è inibita anche da bassi livelli di RacV12.

È noto da tempo che la differenziazione delle cellule epiteliali e degli adipociti richiede confluenza e impegno di cadherins2. Noi e altri abbiamo dimostrato che l'adesione cellulare-cellulare e l'impegno di E- o N-cadherin e cadherin-11, come avviene con la confluenza di cellule coltivate, innesca un drammatico aumento dell'attività del piccolo GTPases Rac e della divisione cellulare controlla la proteina di controllo 42 (Cdc42), e questo processo porta all'attivazione di interleuchina-6 (IL6)...

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Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Descriviamo tecniche per l'induzione della differenziazione di due linee epiteliali mammarie, HC11 ed EpH4. Mentre entrambi richiedono siero di vitello fetale, insulina e prolattina per produrre proteine del latte, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in mammosfere in coltura tridimensionale. Questi modelli complementari sono utili per gli studi di trasduzione del segnale di differenziazione e neostrulasia.

Differenziazione delle cellule epiteliali del seno del topo HC11 e EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Le cellule HC11 ed EpH4 sono linee cellulari epiteliali del seno del topo che possono differenziarsi in coltura. Allo stesso tempo, queste cellule possono essere trasformate da un certo numero di oncogeni. Queste cellule sono ideali per lo studio dell'interrelazione tra differenziazione e trasformazione neoplastica.Queste tecniche possono essere utilizzate negli studi di trasduzione del segnale per scoprire obiettivi per la terapia del cancro. Ad esempio, la piccola GTPasi Rac e altre molecole possono innescare la trasformazione delle cellule epiteliali del seno quando espresse a livelli elevati, ma sorprendentemente a bassi livelli, possono indurre differenziazione. Altri trasduttori di segnale possono comportarsi in modo simile.I principi possono applicarsi anche ad altri tipi di differenziazione in cui la confluenza cellulare gioca un ruolo importante, ad esempio la differenziazione di adipociti o miotubi. Qualcuno che esegue questa tecnica per la prima volta dovrebbe tenere a mente che la placcatura delle cellule HC11 è importante. Questo perché il contatto da cellula a cellula è importante per la differenziazione.Un altro punto da notare è che una corretta estrazione delle cellule EpH4 dalla matrice è fondamentale per la quantificazione delle proteine perché qualsiasi residuo influenzerà la determinazione delle proteine. La dimostrazione visiva di questo metodo è utile perché alcuni dettagli del protocollo sono difficili da descrivere su carta. Inizia preparando una bottiglia di 50 millilitri di mezzo cellulare HC11 secondo le indicazioni del manoscritto.Per placcare le cellule, aspirare il mezzo da cinque piastre di Petri confluenti al 50% di centimetri e lavare le celle con circa 1,8 millilitri di tripside utilizzando una pipetta Pasteur sterile a nove pollici collegata in cotone. Quindi aggiungere 200 microlitri di tripina per piastra e ruotare la piastra per spostare le celle attaccate. Osservare le cellule in microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 4X per assicurarsi che abbiano iniziato a spodestarsi.Quindi aspirare circa 1,5 millilitri di mezzo HC11 con una pipetta Pasteur sterile da nove pollici e spruzzarla verticalmente contro le cellule mentre ruota il piatto assicurandosi di evitare schizzi. Trasferire tutte le celle in bottiglia con mezzo HC11 e ruotare per disperdersi uniformemente nella bottiglia. Quindi aliquote la sospensione cellulare in 20 piastre di Petri di tre centimetri pipettando due millilitri di cellule per piatto.Dondolare le piastre di Petri per diffondere le cellule e incubarle a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno successivo, quando le cellule sono confluenti dal 90 al 100%, aspirano il mezzo e lo sostituiscono con mezzo con FBS ma senza EGF. Dopo aver fatto crescere le cellule in mezzo senza EGF per 24 ore, aggiungere il mezzo di differenziazione a 10 piatti e far crescere le cellule per un massimo di 10 giorni mantenendo gli altri 10 piatti come controlli.Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni con cellule trattate e di controllo HIP. Per monitorare la differenziazione, osservare le cellule con microscopia a contrasto di fase. Utilizzare la microscopia a fluorescenza se le cellule esprimono proteine fluorescenti verdi.Inoltre, quantificare il grado di differenziazione estraendo proteine dalle cellule trattate e di controllo HIP una volta al giorno ed eseguendo l'analisi western Blot. Raccogliere e posizionare il mezzo di crescita EpH4, la matrice EHS e due tubi conici da 50 millilitri sul ghiaccio. Prechill le piastre di coltura tissutale con punte di pipetta a meno 20 gradi Celsius e preparare il mezzo di crescita EpH4 integrato con matrice del 10 o 20% in due tubi conici da 50 millilitri e tenerli sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per l'uso.Dopo aver recuperato le piastre di coltura tissutale prechilled a meno 20 gradi Celsius, rivestire 10 pozzi della piastra a 24 porri con 150 microlitri di matrice non diluita diffondendo la matrice con una pipetta. Evitare di creare bolle quando si diffonde la matrice. Quindi toccare delicatamente i lati della piastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire alla matrice di solidificarsi.Nel frattempo, preparati per la differenziazione tripinando le cellule EpH4 così come precedentemente descritte e garantendo sospensioni a singola cellula dopo la resopensione delle cellule tripsinti. Quindi, conta le cellule in sospensione con un emocitometro. Trasferire cinque volte 10 alle quattro cellule per pozzo in un tubo di centrifuga conico sterile da 1,5 millilitri e girarle a 250 volte g per cinque minuti.Aspirare con cura il mezzo supernatante e posizionare il tubo sul ghiaccio. Utilizzare una punta di pipetta da un millilitro per rimescolare le celle in 350 microlitri di mezzo di crescita EpH4 integrati con una matrice del 20% mantenendo i tubi sul ghiaccio assicurandosi di evitare bolle. Una volta che lo strato inferiore si è solidificato, aggiungere i 350 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzo rivestito e posizionarlo in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire allo strato a matrice del 20% di solidificarsi.Osservare le celle con microscopia a contrasto di fase per assicurarsi che le singole celle siano visibili. Quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo EpH4 con matrice del 10% in cima e incubare la piastra a 37 gradi Celsius. Inizia l'induzione della differenziazione un giorno dopo aver placcato le cellule nella matrice.Rimuovere con cura 150 microlitri del mezzo matrice superiore al 10% e aggiungere 200 microlitri di supporto EpH4 contenente HIP e matrice al 10% e per i controlli aggiungere un mezzo matrice al 10% senza HIP. Sostituire il mezzo ogni due giorni per un massimo di 10 giorni monitorando la formazione della mammosfera con microscopia a contrasto di fase. Per quantificare la differenziazione, pipettare con cura il mezzo HIP a matrice del 10% dai pozzi e risciacquare lo strato a matrice del 20% con 350 microlitri di PBS ghiacciato.Quindi aggiungere da 70 a 100 microlitri di PBS ghiacciato con un EDTA millimolare direttamente nei pozzi e staccare delicatamente lo strato inferiore della matrice al 100% con una punta di pipetta. Agitare delicatamente il piatto a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Trasferire con cura la sospensione dello sferoide su un tubo conico e sciacquare i pozzi con 500 microlitri di PBS EDTA per recuperare eventuali sferoidi rimanenti.Dondolare il tubo sul ghiaccio per altri 30 minuti assicurandosi che la matrice si dissolva completamente. Se si vedono grumi a matrice visibile, aggiungere più PBS EDTA o agitare più a lungo. Centrifugare la soluzione a 350 volte g per pellettare gli sferoidi.Quindi aspirare il supernatante, lisciviare gli sferoidi e sondare le cellule per la beta-caseina, la ciclina D1 e p120RasGAP mediante gonfiore occidentale. C'è una sorprendente dipendenza dalla differenziazione dalla forza del segnale Rac nelle cellule HC11. Mentre il CRAC1 endogeno è necessario per la differenziazione e bassi livelli di RacV12 attivati mutazionalemente causano un aumento della capacità di differenziazione, alti livelli di RacV12 innescano un blocco di differenziazione e inducono neoplasia.Quando le proprietà di differenziazione delle cellule EpH4 sono state esplorate in una coltura di matrice 3D, è stato scoperto che la produzione di beta-caseina ha raggiunto il picco da otto a 10 giorni e l'espressione di cyclin D1 era massima a quattro o sei giorni dopo la stimolazione HIP. Per determinare il posizionamento delle singole celle, sono state macchiate con DAPI e immagini con microscopia confocale. La morte cellulare interna e la formazione di lumen cavi sono state osservate nelle mammosfere mentre l'aggiunta di HGF ha portato alla formazione di strutture tubolari.Qualcuno che esegue questa tecnica per la prima volta dovrebbe tenere a mente che la placcatura delle cellule HC11 è importante. Anche una corretta estrazione delle cellule EpH4 dalla matrice è fondamentale per la quantificazione delle proteine perché eventuali residui influenzeranno la determinazione delle proteine. Questa tecnica può essere utilizzata per indagare altri trasduttori di segnale che possono comportarsi in modo simile.Se ci sono mutazioni del conducente in un cancro, la loro completa inibizione non sarà necessaria poiché bassi livelli rimanenti indurrebbero effettivamente la differenziazione.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Sintesi e caratterizzazione di un profarmaco Aspirina-fumarato che inibisce NFκB attività e della mammella cellule tumorali staminali

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiva comportamento delle cellule cancro al seno umano in Zebrafish embrionali

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-imaging della migrazione delle cellule epiteliali della mammella dopo lo svuotamento transitorio di TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

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