Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
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HC11細胞株はD.メディナ博士(テキサス州ヒューストン)によって親切に提供された。著者らは、多くの試薬と貴重な提案のためにクイーンズ大学のアンドリュー・クレイグ博士に感謝しています。EpH4細胞は、C.ロスケリー博士(バンクーバーのUBC)からの贈り物でした。コリーン・シックは、3D文化研究のための優れた技術支援を提供しました。
カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)、カナダ健康研究所(CIHR)、カナダ乳癌財団(CBCF、オンタリオ支部)、カナダ乳癌研究同盟の資金援助オンタリオ・センター・オブ・エクセレンス、乳がんアクションキングストン(BCAK)、クレア・ネルソンのLRへの助成金による遺贈基金は、感謝の念をうっていいます。CIHR、CBCF、BCAK、がん研究協会から助成金を受けたPTGは、カナダイノベーション財団、CIHR、NSERC、カナダ癌学会のカナダ研究委員長が支援しています。MNは、NCICの学際的がん研究におけるテリー・フォックス・トレーニング・プログラムの学生シップ、大学院賞(QGA)、クイーンズ大学の学部長賞によって支援されました。MGは、アメリカ陸軍乳がんプログラム、オンタリオ州の研究イノベーション省、クイーンズ大学の諮問研究委員会の博士研究員によって支援されました。VHは、CIHRと提携して、学際癌研究におけるテリー・フォックス財団研修プログラムのCBCF博士フェローシップと博士研究員によって支援されました。ハナド・アダンはNSERCの夏の学生シップの受給者でした。BSはクイーンズ大学の大学院賞に支えられていました。

1. HC11細胞のめっき
<ol><li>無菌技術を用いた層流フードでは、HC11細胞培地の50mLのボトルを準備します:10%のウシ胎児血清(FBS)、5 μg/mLインスリン、および10 ng/mL EGFを備えたRPMI-1640(材料表参照)。</li>
	<li>プレート 3 cm ペトリ皿あたり約 400,000 セル: HC11 培地で 20 3 cm の皿に 2 つの 10 cm、50% コンフルエントペトリ皿を渡します。細胞はよく広がらなければならないが、乾燥は避けなけ?...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

HC11細胞は、新生物の形質転換と共に分化の研究に理想的に適しています。さらに、HC11細胞はMo-MLVベースのレトロウイルスベクターに容易に感染し、様々な遺伝子を発現できることが利点です。私たちの手では、EpH4細胞はHC112よりも同じレトロウイルスベクターに感染することがより困難であった。
細胞間接触および増殖停止は、HC11細胞分化のための?...

正常な組織や腫瘍では、細胞は3次元組織で隣人との接着の広範な機会を有し、これは高密度細胞増殖によって培養中に模倣される。細胞間接着は、主にカドヘリン受容体を介して媒介され、細胞および組織の構造を定義する。興味深いことに、カドヘリンは、特に生存シグナル伝達1において、シグナル伝達においても強力な役割を果たしていることを最近実証した。逆説的に、カドヘリンから発せられるこれらの細胞間接着シグナルの一部は、最近、分化と新生物2の両方によって共有されることがわかった。ここでは、マウス胸上皮細胞株の2つの代表的なタイプHC11およびEpH4における分化誘導および評価の方法を記載する。
HC11マウスの胸上皮細胞株は、上皮細胞分化の研究に有用なモデルを提供することができる。HC11細胞は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺由来のCOMMA-1D由来細胞株である3。他のCOMMA−1D誘導体クローンとは対照的に、HC11クローンは、発泡性ホルモン3による内因性β-カゼイン遺伝子のインビトロ誘導のために他の細胞型と外因性付加された細胞外マトリックスまたは共培養のための要件を有さない。この細胞株は、正常乳上皮の重要な特徴を保持しているため分化試験で広く使用されている:HC11細胞は、乳腺脂肪パッド4をクリアして、そのダクト上皮を部分的に再構成することができる。また、Hイドロコルチゾンやデキサメタゾンなどのステロイドの存在下でプラスチックペトリ皿表面に結合して成長した場合に2次元(2D)培養で分化することができ、さらに、表皮成長因子(EGF)を欠く上皮成長因子(EGF)に加えて、5、6、7の異化阻害薬である。これらの条件下では、HC11細胞はβカゼインやWAPなどの乳タンパク質を産生し、これは誘導後4日以内にウェスタンブロッティングによって検出可能である。同時に、HC11細胞の一部は、ストカスティックな方法で「ドーム」と呼ばれている初歩的な乳腺様構造を形成する。ドームは、誘導後4〜5日目に見え、徐々に10日目までサイズが増加し、βカゼイン産生の増加に伴って8.興味深いことに、HC11細胞は変異型p539を有し、したがって前生性状態を表す。このため、HC11モデルは、同じ細胞系の新生物と組み合わせて分化のシグナリングネットワークを研究するのに理想的です。
EPH4細胞は、IM−2細胞の誘導体であり、元来、妊娠中のバルブ/cマウス10から単離された自発的に不死化マウス乳腺上皮細胞に由来する非腫瘍性細胞株である。EpH4細胞は2D培養で連続上皮単層を形成するが、腺様構造10,11に分化しない。しかし、EHSマウス肉腫細胞12によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる材料での3D増殖に続いて(EHSマトリックス、マトリックス、またはマトリゲル、材料の表を参照)、HIPによる刺激に加えて、EpH4細胞は乳腺分化の初期段階を再現することができる。これらの条件下では、EpH4細胞は、吸盤基底極性および中空腔を示す回転楕円体(マンモスフィアとも呼ばれる)を形成し、乳タンパク質β-カゼインおよびWAPを産生し得る。未分化化しているHC11細胞とは対照的に、幾つかは間葉マーカー13を発現するが、EpH4細胞は純粋に発光形態14を示す。EpH4細胞はまた、デキサメタゾン、インスリン、およびプロラクチン15による刺激を通じて2D培養で乳タンパク質を産生することが報告されている。しかし、このアプローチは、3D培養における乳腺微小環境を模倣する調節効果の研究を妨げる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

カドヘリンは、細胞分化および腫瘍の調節において重要な役割を果たす。ここでは、2つのマウス胸上皮細胞株HC11とEpH4の分化誘導の起源と方法、および乳腺の発達と腫瘍性形質転換の相補的段階を研究するためのその使用について説明する。
HC11マウスの乳房上皮細胞系は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺に由来する。これは、胎児の子牛血清およびHイドロコルチゾン、InsulinおよびPロラクチン(HIP培地)を含む培地中のプラスチックペトリ皿表面に結合するように成長した場合に分化する。これらの条件下で、HC11細胞は乳タンパク質βカゼインおよび乳清酸性タンパク質(WAP)を産生し、乳腺上皮細胞の授乳と同様に、初歩的な乳腺様構造を形成し、「ドーム」と呼ばれます。
EpH4細胞株は、妊娠中のバルブ/cマウスから単離された自発的に不死化したマウス乳腺上皮細胞に由来した。HC11とは異なり、EPH4細胞はHIP培地で3次元(3D)増殖条件下で培養すると、スフェロイド(マンモスフィアとも呼ばれる)に完全に分化することができます。細胞はトリプシン化され、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム(EHS)マウス肉腫細胞によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる20%マトリックスで懸濁し、プラスチックペトリ皿またはマルチウェルプレートをコーティングする濃縮マトリックスの層の上にメッキし、10%マトリックス含有HIP培地の層で覆われる。これらの条件下で、EpH4細胞は、尖面基底極性、中空ルーメンを示し、βカゼインおよびWAPを産生する中空回転楕円体を形成する。
これらの技術を用いて、我々の結果は、カドヘリン/Racシグナルの強度がHC11細胞の分化に重要であることを実証した。Rac1は分化に必要であり、活性化されたRacV12の低レベルは分化を増加させるが、高いRacV12レベルは新生物を誘導しながら分化をブロックする。対照的に、EpH4細胞は乳腺上皮分化における初期段階を表し、これは低レベルのRacV12によっても阻害される。

上皮細胞とアディポサイトの分化にはカドヘリン2の合流と関与が必要とすることが長い間知られている。我々および他の人々は、E-またはN-カドヘリンおよびカドヘリン-11の細胞間接着および関与を実証した。 培養細胞の合流と同様に、小さなGTPases Racおよび細胞分裂制御タンパク質42(Cdc42)の活性の劇的な増加を引き起こし、このプロセスはインターロイキン6(IL6)ファミリ?...

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Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

我々は、2つの胸上皮線HC11およびEpH4の分化誘導のための技術を記述する。どちらも乳タンパク質を産生するために胎児の子牛血清、インスリン、プロラクチンを必要としますが、EpH4細胞は3次元培養でマンモスフィアに完全に分化することができます。これらの相補モデルは、分化および新生物のシグナル伝達研究に有用である。

マウス乳房上皮HC11細胞とEpH4細胞の分化

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

HC11およびEpH4細胞は、培養中に分化し得るマウス乳房上皮細胞株である。同時に、これらの細胞は、多数の腫瘍遺伝子によって形質転換され得る。これらの細胞は、分化と腫瘍性の形質転換との相互関係の研究に最適です。これらの技術は、がん治療の標的を発見するためにシグナル伝達研究で使用することができる。例えば、小さなGTPase Racおよび他の分子は、高レベルに発現すると乳房上皮細胞の形質転換を引き起こす可能性があるが、驚くべきことに低レベルでは分化を誘発する可能性がある。他の信号トランスデューサも同様の動作をする場合があります。この原理は、細胞合流が重要な役割を果たす他のタイプの分化(例えば、有数細胞または筋管の分化)にも適用される。この技術を初めて行う人は、HC11細胞のめっきが重要であることを覚えておいてください。これは、細胞間接触が分化に重要であるためである。注意すべきもう一つのポイントは、任意の残基がタンパク質の決定に影響を与えるので、マトリックスからのEpH4細胞の適切な抽出がタンパク質定量に重要であるということです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、プロトコルの一部の詳細を紙に記述することが困難であるため、便利です。原稿の指示に従ってHC11細胞培地の50ミリリットルのボトルを準備することによって開始します。細胞をプレートするには、5つの6センチメートル50%コンフルエントペトリ皿から培地を吸引し、無菌9インチの綿を差し込んだパスツールピペットを使用して約1.8ミリリットルのトリプシンで細胞を洗います。その後、プレートあたり200マイクロリットルのトリプシンを加え、プレートを旋回して取り付けられた細胞を取り除きます。4Xの目的で位相対視下の細胞を観察し、外れ始めたことを確認します。その後、無菌9インチのパスツールピペットで約1.5ミリリットルのHC11培地を吸引し、飛び散らないように皿を回転させながら細胞に対して垂直に噴出します。すべての細胞をHC11培地でボトルに移し、渦巻いてボトルに均等に分散させます。その後、1皿あたり2ミリリットルの細胞をピペット処理することによって、細胞懸濁液を20の3センチメートルのペトリ皿にアリコートする。ペトリ皿を揺らし、細胞を広げ、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。次の日に細胞が90〜100%コンフルエントである場合、培地を吸引し、それをFBSで培地に置き換えますが、EGFを使用しない。24時間EGFなしで培地で細胞を成長させた後、10皿に分化培地を追加し、コントロールとして他の10の料理を維持するために最大10日間細胞を成長させます。HIP処理細胞とコントロールセルの両方で、2~3日ごとに培地を交換します。分化を監視するには、位相コントラスト顕微鏡で細胞を観察します。細胞が緑色蛍光タンパク質を発現している場合は蛍光顕微鏡を使用してください。さらに、HIP処理細胞からタンパク質を抽出し、細胞を1日1回コントロールし、ウェスタンブロット分析を行うことで、分化の程度を定量化します。EpH4成長培地、EHSマトリックス、および2つの円錐50ミリリットルチューブを氷の上に集めて配置します。マイナス20°Cのピペットチップを備えた組織培養プレートをプレチルし、2つの50ミリリットル円錐形チューブで10または20%マトリックスを添加したEpH4成長培地を準備し、使用する準備ができるまで氷の上に保管します。プレチルド組織培養プレートをマイナス20度で取り出した後、ピペットでマトリックスを広げ、希釈されていないマトリックスの150マイクロリットルで24ウェルプレートのウェル10をコーティングします。マトリックスを広げるときには、バブルを作成しないようにします。その後、プレートの側面をそっとタップし、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートし、マトリックスを固めます。一方、先に述べたEpH4細胞をトリプシン化し、トリプシン化細胞の再懸濁後に単細胞懸濁液を確保することにより、分化に備える。次に、ヘモサイトメーターで懸濁液中の細胞を数える。1.5ミリリットルの無菌円錐型遠心分離管にウェルあたり4つの細胞に5回10回移し、5分間gの250倍でそれらを回転させます。上清媒体を慎重に吸引し、チューブを氷の上に置きます。1ミリリットルのピペットチップを使用して、20%マトリックスを補充したEpH4成長培地の350マイクロリットルの細胞を再懸濁し、氷上のチューブを気泡を避けるようにします。底層が固まったら、コーティングされた各ウェルに350マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、20%マトリックス層を固化させるために1時間摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに入れます。位相コントラスト顕微鏡で細胞を観察し、単一の細胞が見えるようにします。その後、上に10%マトリックスを持つEpH4培地の200マイクロリットルを加え、37°Cでプレートをインキュベートします。マトリックス内の細胞をめっきした翌日に分化誘導を開始する。慎重にトップ10%マトリックス培地の150マイクロリットルを除去し、HIPと10%マトリックスを含むEpH4培地の200マイクロリットルを追加し、コントロールのためにHIPなしの10%マトリックス培地を追加します。位相コントラスト顕微鏡で最大10日間の監視用の培地を2日ごとに交換します。分化を定量化するには、10%マトリックスHIP培地をウェルから慎重にピペットオフし、氷冷PBSの350マイクロリットルで20%マトリックス層をすすいだ。その後、1ミリモルEDTAを持つ氷冷PBSの70〜100マイクロリットルを直接井戸に加え、ピペットチップで100%マトリックスの底層を静かに取り外します。プレートを摂氏4度で30分間軽く振ります。慎重に円錐形のチューブにスフェロイド懸濁液を移し、残りのスフェロイドを回復するためにPBS EDTAの500マイクロリットルでウェルをすすいだ。さらに30分間氷の上でチューブを揺らし、マトリックスが完全に溶解することを確認します。可視マトリックスの塊が見られる場合は、PBS EDTAを追加するか、長く振ります。溶液を350倍gで遠心分離し、スフェロイドをペレットする。次いで上清を吸引し、スフェロイドをライスし、ウェスタンブロッティングによりβカゼイン、サイクリンD1、およびp120RasGAPの細胞をプローブする。HC11細胞のRacシグナルの強さに対する分化の顕著な依存性がある。内因性CRAC1は分化に必要であり、変異活性化RacV12の低レベルは分化能力の増加を引き起こすが、高いRacV12レベルは分化のブロックを誘発し、新生物を誘導する。EpH4細胞の分化特性を3Dマトリックス培養で調べたところ、βカゼイン産生は8~10日でピークに達し、CYCLIN D1発現はHIP刺激後4~6日で最大であったことがわかりました。個々の細胞の位置を決定するために、それらはDAPIで染色され、共焦点顕微鏡でイメージングした。内部細胞死および中空腔の形成はマンモスフィアで観察され、HGFの添加は管状構造の形成をもたらした。この技術を初めて行う人は、HC11細胞のめっきが重要であることを覚えておいてください。また、任意の残基がタンパク質の決定に影響を与えるので、マトリックスからのEpH4細胞の適切な抽出は、タンパク質定量のために重要です。この手法を使用して、同様の方法で動作する他の信号トランスデューサを調べることができます。癌にドライバー突然変異がある場合、残りの低レベルが実際に分化を誘発するので、その完全な阻害は必要ありません。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

NFκB活性および乳癌幹細胞を阻害するアスピリン、フマル酸プロドラッグの合成とキャラクタリゼーション

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブ イメージング

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

マウス乳腺へのクレオンゲンデノウイルスの誘導注射による乳癌のモデル化

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

オルガノイド培養を用いたマウス前立腺上皮細胞の分化能力の評価

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...