Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

HC11 세포주들은 D. 메디나 박사(휴스턴, 텍사스 주)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 저자는 많은 시약과 가치있는 제안에 대한 퀸즈 대학의 박사 앤드류 크레이그에 감사드립니다. EpH4 세포는 C. Roskelley 박사 (UBC, 밴쿠버)의 선물이었습니다. Colleen Schick은 3D 문화 연구를 위한 우수한 기술 지원을 제공했습니다.
캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 캐나다 보건 연구 기관 (CIHR), 캐나다 유방암 재단 (CBCF, 온타리오 지부), 캐나다 유방암 연구 연합의 재정 지원 , 우수의 온타리오 센터, 유방암 액션 킹스턴 (BCAK) 및 LR에 보조금을 통해 클레어 넬슨 유증 기금은 감사하게 인정된다. CIHR, CBCF, BCAK 및 암 연구 학회 Inc.의 보조금 지원을 받은 PTG는 캐나다 연구 위원장, 캐나다 혁신 재단, CIHR, NSERC 및 캐나다 암 학회가 후원합니다. MN은 NCIC에서 학제 암 연구에서 테리 폭스 교육 프로그램에서 학생, 대학원 상 (QGA), 그리고 여왕의 대학에서 학장상에 의해 지원되었다. MG는 미국 육군 유방암 프로그램, 온타리오 주 연구 혁신부 및 퀸즈 대학의 자문 연구위원회에서 박사 후 펠로우십을 지원받았습니다. VH는 CIHR과 협력하여 테리 폭스 재단 교육 프로그램에서 CBCF 박사 펠로우십과 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 하나드 아단은 NSERC 여름 학생의 수혜자였다. BS는 퀸즈 대학 대학원 상에 의해 지원되었다.

1. 도금 HC11 셀
<ol><li>멸균 기술을 사용하는 층류 후드에서 HC11 세포 배지의 50 mL로 병을 제조합니다: RPMI-1640 과 10% 태아 소 혈청 (FBS), 5 μg/mL 인슐린, 및 10 ng/mL EGF (재료 표참조).</li>
	<li>접시 3 cm 페트리 접시 당 약 400,000 세포 : HC11 매체에 20 3cm 접시에 두 개의 10cm, 50 % confluent 페트리 접시를 전달합니다. 세포는 잘 퍼져 있어야하지만 건조는 피해야합니다.<ol>
<li>진공 펌프를 사용하여 ?...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

HC11 세포는 신생물 형형과 함께 분화 연구에 이상적입니다. 추가적인 이점은 HC11 세포가 다양한 유전자를 발현하기 위해 Mo-MLV 기반 레트로바이러스 벡터로 쉽게 감염될 수 있다는 것입니다. 우리의 손에, EpH4 세포는 HC112보다는 동일 retroviral 벡터로 감염하는 것을 더 어려웠습니다.
세포 대 세포 접촉 및 성장 체포는 HC11 세포 분화를 위한 중요한 전제 조건입?...

일반적인 조직 또는 종양에서, 세포는 3차원 조직에서 그들의 이웃에 접착을 위한 광대한 기회를 가지고 있고, 이것은 고밀도 세포 성장에 의해 배양에서 모방됩니다. 세포 대 세포 접착은 주로 세포 및 조직 구조를 정의하는 카데린 수용체를 통해 매개됩니다. 흥미롭게도, 최근에 는 카데린이 특히 생존 신호1에서신호 변환에 강력한 역할을한다는 것을 입증되었습니다. 역설적으로, 카데린으로부터 방출되는 이들 세포 간 접착 신호 중 일부는 최근 분화 및 신생물2둘 다에 의해 공유되는 것으로 밝혀졌다. 여기서, 우리는 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 두 가지 대표적인 유형에서 분화의 유도 및 평가 방법을 기술한다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 상피 세포 분화의 연구에 유용한 모델을 제공할 수 있다. HC11 세포는 COMMA-1D 유래 세포주이며, 임신 중발/c 마우스3의유선에서 유래한다. 다른 COMMA-1D 유도체 클론과 달리, HC11 클론은 유생 호르몬에 의한 내인성 β-카제인 유전자의 체외 유도에 대한 다른 세포 유형과의 외인성 세포 간 매트릭스 또는 동조를 위한 요건이 없다3. 이러한 세포주는 정상 유방 상피의 중요한 특성을 유지했기 때문에 분화 연구에서 광범위하게 사용되어 왔다: HC11 세포는 클리어된 유방 지방 패드4에서덕트 상피를 부분적으로 재구성할 수 있다. 더욱이, 그들은 H이드로코르티손 또는 덱사메타손과 같은 스테로이드의 존재에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 2차원(2D) 배양물에서 분화할 수 있으며, 이외에도I은술린과 P롤락틴(HIP 배지)이 결여되어 표피 성장 인자(EGF), 분화 억제제5,6,7. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 β-카제인 및 WAP와 같은 우유 단백질을 생성하며, 이는 유도 후 4일 이내에 서양 블로팅에 의해 검출됩니다. 동시에, HC11 세포의 부분은 초보적인 유방 선과 같은 구조를 형성하여 "돔"이라고 불리는 지형적 방식으로. 돔은 유도 후 4-5일 동안 볼 수 있으며 점차 적으로 크기가 10일까지 증가하고, β-카제인 생산량의 증가와 함께8. 흥미롭게도, HC11 세포는 돌연변이 p539를소유하고, 따라서 전뇌성 상태를 나타낸다. 이러한 이유로, HC11 모델은 동일한 세포 시스템에서 신생물과 함께 분화의 신호 네트워크를 연구하는 데 이상적입니다.
EPH4 세포, IM-2 세포의 유도체는, 원래 임신 중 발브/c마우스(10)로부터분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래된 비종양성 세포주이다. EpH4 세포는 2D 배양에서 연속상피 단층을 형성하지만 선형구조(10,11)로분화하지 는 않는다. 그러나, EHS 마우스 육종세포(12)에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 이루어진 물질의 3D 성장에 이어(EHS 매트릭스, 매트릭스, 또는 마트리겔, 물질표참조), HIP를 가진 자극 이외에, EpH4 세포는 유방선 분화의 초기 단계를 재차화할 수 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 심근 기저 극성과 중공 루멘을 나타내는 스페로이드 (유방 골격이라고도 함)를 형성하며, 수유 유방 상피 세포와 유사한 우유 단백질 β-카제인 및 WAP를 생성 할 수 있습니다. 미분화되는 HC11 세포와는 달리, 일부 발현 중간엽마커(13)EpH4 세포는 순수한 발광형태(14)를나타낸다. EpH4 세포는 또한 덱사메타손, 인슐린 및 프롤락틴15를통한 자극을 통해 2D 배양에서 우유 단백질을 생산하는 것으로 보고되었다. 그러나, 이 접근은 3D 문화에서 유방 동맥 미세 환경을 모방하는 규정 효력의 연구 결과 배제합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Cadherins는 신생물뿐만 아니라 세포 분화의 조절에 중요한 역할을합니다. 여기에서 우리는 2개의 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 분화의 유도의 기원 그리고 방법 및 유방 선 발달 및 신생물 변환의 상호 보완적인 단계를 공부하기 위하여 그들의 사용을 기술합니다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 임신 한 Balb / c 마우스의 유선에서 유래. 태아 송아지 혈청 및 H이드로코르티손, I은린및 P롤락틴(HIP 배지)을 함유하는 배지에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 차별화된다. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 모유 단백질 β-카제인과 유청 산성 단백질(WAP)을 생산하며, 수유 유방 상피 세포와 유사하며, "돔"이라고 불리는 초보적인 유선 구조를 형성합니다.
EpH4 세포주는 임신한 Balb/c 마우스로부터 분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래되었다. HC11과 달리 EpH4 세포는 HIP 배지에서 3차원(3D) 성장 조건하에서 배양할 때 스페로이드(맘모스피어라고도 함)로 완전히 분화할 수 있습니다. 세포는 트립시네화되고, 엥겔브레스-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 구성된 20% 매트릭스에서 부유하고, 플라스틱 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트를 코팅하는 농축 매트릭스 층 위에 도금되고, 10% 매트릭스 함유 HIP 배지의 층으로 덮여 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 정점 기저 극성, 중공 루멘을 나타내는 중공 스페로이드를 형성하고 β-카제인 및 WAP를 생성합니다.
이러한 기술을 사용하여, 우리의 결과는 카데린 / Rac 신호의 강도가 HC11 세포의 분화에 중요하다는 것을 입증했다. Rac1은 분화에 필요하고 활성 RacV12의 낮은 수준은 분화를 증가시키는 반면, 높은 RacV12 레벨은 신생물을 유도하면서 분화를 차단한다. 대조적으로, EpH4 세포는 RacV12의낮은 수준에 의해 억제되는 유방 상피 분화에 있는 초기 단계를 나타냅니다.

상피 세포와 지방세포의 분화가 카데린2의합류와 결합을 필요로 한다는 것은 오랫동안 알려져 왔다. 당사와 다른 사람들은 세포 간 부착 및 E-또는 N-카데린 및 카데린-11의 결합을 입증했습니다. 배양 된 세포의 합류와 함께 발생, 작은 GTPases Rac 및 세포 분열 제어 단백질 (Cdc42)의 활성의 극적인 증가를 트리거,이 과정은 인터류킨 -6 (IL6) 가족 사이토 카인 및 Stat3의 활성화로 이어?...

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Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

우리는 2개의 유방 상피 선, HC11 및 EpH4의 분화 유도를 위한 기술을 기술합니다. 둘 다 우유 단백질을 생성하기 위하여 태아 송아지 송아지 혈청, 인슐린 및 prolactin를 요구하는 동안, EpH4 세포는 3 차원 문화에서 유방구로 완전히 분화할 수 있습니다. 이러한 상보적인 모델은 분화 및 신생물의 신호 환전 연구에 유용하다.

마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

HC11 및 EpH4 세포는 배양에서 분화할 수 있는 마우스 유방 상피 세포주입니다. 동시에, 이 세포는 다수의 종양 유전자에 의해 변형될 수 있다. 이 세포는 분화와 신생물 성 변환 사이의 상호 관계에 대한 연구에 이상적입니다.이 기술은 암 치료를 위한 표적을 찾아내기 위하여 신호 변환 연구 결과에서 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 작은 GTPase Rac 및 기타 분자는 높은 수준으로 발현될 때 유방 상피 세포의 변환을 시작할 수 있지만, 놀랍게도 낮은 수준에서, 그들은 차별화를 유도할 수 있습니다. 다른 신호 변환기도 유사한 방식으로 작동할 수 있습니다.원리는 세포 합류가 백분세포 또는 근구의 분화와 같은 중요한 역할을 하는 다른 유형의 분화에도 적용될 수 있습니다. 처음으로이 기술을 수행하는 사람은 HC11 세포의 도금이 중요하다는 것을 명심해야합니다. 이는 세포 간 접촉이 분화에 중요하기 때문입니다.주의해야 할 또 다른 점은 매트릭스에서 EpH4 세포를 적절히 추출하는 것이 단백질 수량에 매우 중요하다는 것입니다. 이 메서드의 시각적 데모는 프로토콜의 일부 세부 사항을 종이에 설명하기 어렵기 때문에 유용합니다. 원고 방향에 따라 HC11 세포 배지의 50 밀리리터 병을 준비하는 것으로 시작합니다.세포를 접시에 담기 위해, 5 6 센티미터 50 %의 컨물 페트리 접시에서 배지를 흡인하고 멸균 9 인치 면이 파전소 파이펫을 사용하여 트립신의 약 1.8 밀리리터로 세포를 세척합니다. 그런 다음 플레이트 당 트립신 200 마이크로 리터를 추가하고 부착 된 세포를 제거하기 위해 접시를 소용돌이. 그들이 빠지기 시작했는지 확인하기 위해 4X 목표를 가진 상 대비 현미경 검사법의 밑에 세포를 관찰하십시오.그런 다음 멸균 된 9 인치 파스퇴르 파이펫으로 HC11 배지의 약 1.5 밀리리터를 흡인하고 접시를 회전시키면서 세포에 수직으로 분출하여 튀는 것을 방지합니다. 모든 셀을 HC11 배지로 병에 옮기고 소용돌이를 통해 병에 고르게 분산시십시오. 그런 다음 요리 당 세포의 두 밀리리터를 파이프하여 20 3 센티미터 페트리 접시에 세포 현탁액을 알리쿼팅합니다.페트리 접시를 흔들어 세포를 퍼뜨리고 하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 다음 날에 세포가 90 ~ 100 %의 컨실수인 다음 날에 매체를 흡인하고 FBS로 매체로 대체하지만 EGF없이 교체하십시오. 24시간 동안 EGF 없이 배지에서 세포를 성장한 후, 분화 매체를 10개의 접시에 추가하고 다른 10가지 요리를 대조군으로 유지하여 최대 10일 동안 세포를 성장시다.HIP 처리 및 제어 셀로 2~3일마다 배지를 변경합니다. 분화를 모니터링하려면 위상 대비 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포가 녹색 형광 성 단백질을 표현하는 경우 형광 현미경 검사를 사용합니다.또한, HIP 치료 및 대조세포로부터 단백질을 추출하고 하루에 한 번 조절하여 분화 정도를 정량화하고 서양 블롯 분석을 수행한다. EpH4 성장 매체, EHS 매트릭스 및 두 개의 원물 50 밀리리터 튜브를 얼음 위에 모으고 놓습니다. 영하 20도의 파이펫 팁으로 조직 배양 판을 미리 식히고 2개의 50밀리리터 원추형 튜브에 10 또는 20% 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 매체를 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오.영하 20도에서 미리 냉각된 조직 배양 판을 검색한 후, 파이펫으로 매트릭스를 퍼뜨리면 희석되지 않은 매트릭스 150 마이크로리터로 24웰 플레이트의 10개의 우물을 코팅합니다. 행렬을 퍼뜨릴 때 거품을 만들지 마십시오. 그런 다음 접시의 측면을 부드럽게 탭하고 매트릭스가 고화될 수 있도록 1시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.한편, 이전에 설명된 바와 같이 EpH4 세포를 시험화하고 트립시화 세포의 재발 후 단일 세포 현탁액을 보장함으로써 분화를 준비한다. 다음으로, 혈전계로 현탁액의 세포를 계산합니다. 잘 1.5 밀리리터 멸균 원심분리기 튜브로 잘 10개 세포로 5회 10번 옮기고 5분 동안 250배 g로 회전한다.조심스럽게 슈퍼 나탄 매체를 흡인하고 얼음에 튜브를 배치합니다. 1 밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 20% 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 매체의 350 마이크로리터에서 세포를 재보습하는 동시에 얼음에 튜브를 유지하여 거품을 피하십시오. 바닥층이 고화되면, 잘 코팅된 각 세포 현탁액에 350 마이크로리터를 추가하고 20% 매트릭스 층이 고화될 수 있도록 1시간 동안 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다.단 하나 세포가 보이는지 확인하기 위하여 상 대비 현미경 검사법을 가진 세포를 관찰하십시오. 그런 다음 상단에 10 %의 매트릭스와 EpH4 매체의 200 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 매트릭스에서 세포를 도금 한 후 하루 분화 유도를 시작합니다.상위 10% 매트릭스 매체의 150 마이크로리터를 조심스럽게 제거하고 HIP및 10% 매트릭스를 포함하는 EpH4 배지 200 마이크로리터를 추가하고 HIP 없이 10% 매트릭스 매체를 추가합니다. 유방 구체 형성을 위상 대비 현미경으로 최대 10 일 동안 매질을 2 일마다 교체하십시오. 차별화를 정량화하기 위해 우물에서 10% 매트릭스 HIP 배지를 조심스럽게 피펫하고 얼음 차가운 PBS 350 마이크로리터로 20%매트릭스 층을 헹구는 다.그런 다음 70~100마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 1밀리머 EDTA를 우물에 직접 넣고 파이펫 팁으로 100% 매트릭스의 바닥층을 부드럽게 분리합니다. 접시를 섭씨 4도에서 30분간 부드럽게 흔들어 줍니다. 스페로이드 서스펜션을 원피스 튜브로 조심스럽게 옮기고 500마이크로리터의 PBS EDTA로 우물을 헹구어 남은 스페로이드를 회수합니다.매트릭스가 완전히 용해되도록 추가로 30 분 동안 얼음에 튜브를 바위. 보이는 매트릭스 덩어리가 표시되면 PBS EDTA를 더 추가하거나 더 길게 흔들어 줍니다. 350배 g의 원심분리제로 스페로이드를 펠릿합니다.그런 다음 슈퍼나탄을 흡인시키고, 스페로이드를 용해시키고, 서양 블로팅에 의해 베타 카제인, 사이클린 D1 및 p120RasGAP세포를 조사한다. HC11 세포에서 Rac 신호의 강도에 대한 분화의 눈에 띄는 의존도가 있습니다. 내인성 CRAC1은 분화에 필요하고 돌연변이 활성화 된 RacV12의 낮은 수준은 분화 능력의 증가를 야기하지만, 높은 RacV12 수준은 분화의 블록을 트리거하고 신동을 유도한다.EpH4 세포의 분화 특성이 3D 매트릭스 배양에서 탐구되었을 때, 베타 카제인 생성이 8~10일에서 정점에 이르렀고 사이클린 D1 발현은 HIP 자극 후 4~6일 에서 최대화된 것으로 나타났다. 개별 세포의 위치를 결정하기 위하여는, 그(것)들은 DAPI로 염색되고 공초점 현미경으로 심화되었습니다. HGF를 첨가하면서 유방스피어에서 중공 루멘의 내부 세포 사멸 및 형성이 관찰되어 관 구조의 형성을 초래하였다.처음으로이 기술을 수행하는 사람은 HC11 세포의 도금이 중요하다는 것을 명심해야합니다. 또한 매트릭스에서 EpH4 세포의 적절한 추출은 어떤 잔류물이 단백질 결정에 영향을 미치기 때문에 단백질 수량에 매우 중요합니다. 이 기술은 유사한 방식으로 동작할 수 있는 다른 신호 변환기를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.암에 있는 드라이버 돌연변이가 있는 경우에, 그 때 그들의 완전한 억제는 낮은 수준이 실제로 분화를 유도할 것이기 때문에 필요하지 않을 것입니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

NFκB 활동과 유방암 줄기 세포를 금지합니다 합성 및 아스피린 - 푸마 레이트의 전구 약물의 특성

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

연구

암 연구학

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic 쥐 유 방 지방 패드 유방암 세포의 주입

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스의 경막 주사를 통해 유방암 모델링

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

유방암을 위한 전임상 모형으로 유방 종양의 정형소 이식

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...