Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

HC11 cellelinjen ble vennlig levert av Dr. D. Medina (Houston, TX). Forfatterne er takknemlige til Dr. Andrew Craig fra Queen's University for mange reagenser og verdifulle forslag. EpH4 celler var en gave fra Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ga utmerket teknisk assistanse for 3D kulturstudier.
Den økonomiske hjelpen fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), Canadian Breast Cancer Research Alliance , Ontario Centres of Excellence, Breast Cancer Action Kingston (BCAK) og Clare Nelson bequest fondet gjennom tilskudd til LR er takknemlig anerkjent. BE fikk støtte fra CIHR, CBCF, BCAK og Cancer Research Society Inc. PTG støttes av en Canada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC og Canadian Cancer Society. MN ble støttet av et studentskip fra Terry Fox Training Program i transdisciplinary Cancer Research fra NCIC, en Graduate award (QGA), og en Dean's Award fra Queen's University. MG ble støttet av postdoktorstipend fra US Army Breast Cancer Program, Ministry of Research and Innovation i provinsen Ontario og Advisory Research Committee of Queen's University. VH ble støttet av et CBCF doktorgradsstipend og et postdoktorstipend fra Terry Fox Foundation Training Program i Transdisciplinary Cancer Research i samarbeid med CIHR. Hanad Adan var mottaker av en NSERC sommer studentskap. BS ble støttet av en Queen's University graduate award.

1. Plating HC11 Celler
<ol><li>I en laminar strømningshette ved hjelp av sterile teknikker forberede en flaske med 50 ml HC11 cellemedium: RPMI-1640 med 10% føtal storfe serum (FBS), 5 μg/ml insulin, og 10 ng/ml EGF (se Tabell over materialer).</li>
	<li>Plate ca 400.000 celler per 3 cm Petri skål: Pass to 10 cm, 50% confluent Petri retter i tjue 3 cm retter i HC11 medium. Cellene må være godt spredt ut, men tørking må unngås.<ol>
<li>Aspirer mediet inn i en kolbe ved hjelp av en vakuumpumpe.<...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

HC11 celler er ideelt egnet for studiet av differensiering i forbindelse med neoplastisk transformasjon. En ekstra fordel er at HC11-celler lett kan infiseres med Mo-MLV-baserte retrovirale vektorer for å uttrykke en rekke gener. I våre hender var EpH4-celler vanskeligere å infisere med de samme retrovirale vektorene enn HC112.
Celle-til-celle-kontakt og vekstarrest er viktige forutsetninger for HC11-celledifferensiering. Dermed, for å oppnå ensartet differensierin...

I normale vev eller svulster har celler omfattende muligheter for vedheft til sine naboer i en tredimensjonal organisasjon, og dette etterlignes i kultur ved høy tetthet cellevekst. Celle-til-celle adhesjon er mediert hovedsakelig gjennom kadherin reseptorer, som definerer celle og vev arkitektur. Interessant, det ble nylig vist at kadheriner også spille en kraftig rolle i signaltransduksjon, spesielt i overlevelse signaliserer1. Paradoksalt nok ble noen av disse celle-til-celle-adhesjonssignalene som kommer fra kadheriner nylig funnet å bli delt av både differensiering og neoplasi2. Her beskriver vi metoder for induksjon og vurdering av differensiering i to representative typer musbrystepitelcellelinjer, HC11 og EpH4.
HC11 mus bryst epitelcellelinjen kan gi en nyttig modell for studiet av epitelcelledifferensiering. HC11 celler er en COMMA-1D-avledet cellelinje, stammer fra brystkjertelen av en mid-gravid Balb / c mus3. I motsetning til andre COMMA-1D derivatkloner har HC11-klonen ikke noe krav til eksogene ekstracellulære matrise eller codyrking med andre celletyper for in vitro induksjon av endogene β-kaseingen ved laktogene hormoner3. Denne cellelinjen har blitt brukt mye i differensieringsstudier fordi den har beholdt viktige egenskaper ved det normale brystepitelet: HC11-celler kan delvis rekonstituere det kanalepitelet i en ryddet brystfettpute4. Videre kan de skille seg i en todimensjonal (2D) kultur når de dyrkes til samløpet festet til en plast Petri parabolen overflaten i nærvær av et steroid som Hydrocortisone eller Deksametason, i tillegg til jegnsulin og Prolactin (HIP medium) mangler epidermal vekstfaktor (EGF), en hemmer av differensiering5,6,7. Under disse forholdene produserer HC11-celler melkeproteiner som β-kasein og WAP, som kan påvises ved vestlig flekking innen 4 dager etter induksjon. Samtidig danner en del av HC11-celler rudimentære brystkjertellignende strukturer kalt "kupler" på en stokastisk måte. Dopler er synlige 4–5 dager etter induksjon og gradvis økning i størrelse opp til dag 10, samtidig med en økning i β-kaseinproduksjon8. Interessant, HC11 celler har mutert p539, og representerer derfor en preneoplastisk tilstand. Av denne grunn er HC11-modellen ideelt egnet til å studere signalnettverk av differensiering i forbindelse med neoplasi i samme cellesystem.
EpH4 celler, et derivat av IM-2 celler, er en ikke-tumorigen cellelinje opprinnelig avledet fra spontant udødeliggjort mus brystkjertel epitelceller isolert fra en mid-gravid Balb / c mus10. EpH4-celler danner kontinuerlige epitelmonolayers i 2D-kultur, men skiller ikke mellom i kjertellignende strukturer10,11. Men etter 3D-vekst i et materiale som består av en blanding av ekstracellulære matriseproteiner produsert av EHS musesarkomceller12 (EHS matrise, matrise eller Matrigel, se Tabell over materialer), i tillegg til stimulering med HIP, kan EpH4-celler rekapitulere de første stadiene av brystkjerteldifferensiering. Under disse forholdene danner EpH4-celler sfæroider (også kalt mammosfærer) som viser apical-basal polaritet og en hul lumen, og er i stand til å produsere melkeproteinene β-kasein og WAP, som ligner på ammende brystepitelceller. I motsetning til HC11 celler, som er udifferensiert, og noen uttrykker mesenchymal markører13,EpH4 celler viser en rent luminal morfologi14. EpH4-celler har også blitt rapportert å produsere melkeproteiner i 2D-kultur gjennom stimulering med deksametason, insulin og prolaktin15. Denne tilnærmingen utelukker imidlertid studiet av regulatoriske effekter som etterligner mikromiljøet i brystkjertelen i 3D-kulturen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Kadheriner spiller en viktig rolle i reguleringen av celledifferensiering samt neoplasi. Her beskriver vi opprinnelsen og metodene for induksjon av differensiering av to musbrystepitelcellelinjer, HC11 og EpH4, og deres bruk for å studere komplementære stadier av brystkjertelutvikling og neoplastisk transformasjon.
HC11 mus bryst epitelcellelinjen stammer fra brystkjertelen til en gravid Balb / c mus. Det skiller når den dyrkes til samløpet festet til en plast Petri parabolen overflate i medium som inneholder fosterkalv serum og Hydrocortisone, jegnsulin og Prolactin (HIP medium). Under disse forholdene produserer HC11-celler melkeproteinene β-kasein og mysesurt protein (WAP), som ligner på ammende brystepitelceller, og danner rudimentære brystkjertellignende strukturer kalt "kupler".
EpH4 cellelinjen ble avledet fra spontant udødeliggjort mus brystkjertel epitelceller isolert fra en gravid Balb / c mus. I motsetning til HC11 kan EpH4-celler fullt ut differensiere til sfæroider (også kalt mammosfærer) når de dyrkes under tredimensjonale (3D) vekstforhold i HIP-medium. Celler er trypsinized, suspendert i en 20% matrise bestående av en blanding av ekstracellulære matriseproteiner produsert av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mussarkomceller, belagt på toppen av et lag med konsentrert matrisebelegg en plast Petri-tallerken eller multiwell plate, og dekket med et lag på 10% matriseholdige HIP medium. Under disse forholdene danner EpH4-celler hule sfæroider som viser apical-basal polaritet, en hul lumen, og produserer β-kasein og WAP.
Ved hjelp av disse teknikkene viste våre resultater at intensiteten av kadherin / Rac-signalet er avgjørende for differensiering av HC11-celler. Mens Rac1 er nødvendig for differensiering og lave nivåer av aktivert RacV12 øke differensiering, høye RacV12 nivåer blokkere differensiering mens indusere neoplasi. I motsetning representerer EpH4-celler et tidligere stadium i mammary epiteldifferensiering, som hemmes av selv lave nivåer av RacV12.

Det har lenge vært kjent at differensiering av epitelceller og adipocytter krever samløpet og engasjement av kadheriner2. Vi og andre viste at celle-til-celle adhesjon og engasjement av E- eller N-kadherin og kadherin-11, som oppstår med samløpet av kultiverte celler, utløser en dramatisk økning i aktiviteten til de små GTPases Rac og celledeling kontroll protein 42 (Cdc42), og denne prosessen fører til aktivering av interleukin-6 (IL6) familie cytokiner og Stat3 (signal transduser og akti...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Vi beskriver teknikker for differensiering induksjon av to bryst epitellinjer, HC11 og EpH4. Mens begge krever fosterkalvserum, insulin og prolaktin for å produsere melkeproteiner, kan EpH4-celler fullt ut skille seg inn i mammosfærer i tredimensjonal kultur. Disse komplementære modellene er nyttige for signaltransduksjonsstudier av differensiering og neoplasi.

Differensiering av mus bryst epitel HC11 og EpH4 celler

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

HC11- og EpH4-cellene er musebryst epitelcellelinjer som kan skille mellom kultur. Samtidig kan disse cellene forvandles av en rekke onkogener. Disse cellene er ideelle for studiet av forholdet mellom differensiering og neoplastisk transformasjon.Disse teknikkene kan brukes i signaltransduksjonsstudier for å oppdage mål for kreftbehandling. For eksempel kan den lille GTPase Rac og andre molekyler utløse transformasjon av bryst epitelceller når uttrykt til høye nivåer, men overraskende på lave nivåer, de kan indusere differensiering. Andre signaltransdusere kan oppføre seg på samme måte.Prinsippene kan gjelde for andre typer differensiering også hvor celle samløpet spiller en viktig rolle, for eksempel differensiering av adipocytter eller myotubes. Noen som utfører denne teknikken for første gang bør huske på at plating av HC11 cellene er viktig. Dette skyldes at celle-til-celle-kontakt er viktig for differensiering.Et annet poeng å se opp er at riktig utvinning av EpH4-celler fra matrisen er avgjørende for proteinmengde fordi eventuelle rester vil påvirke proteinbestemmelse. Visuell demonstrasjon av denne metoden er nyttig fordi noen detaljer om protokollen er vanskelige å beskrive på papir. Start med å forberede en flaske med 50 milliliter HC11 cellemedium i henhold til manuskriptretninger.For å plate cellene, aspirere mediet fra fem seks centimeter 50% confluent Petri retter og vaske cellene med ca 1,8 milliliter trypsin ved hjelp av en steril ni tommers bomull plugget Pasteur pipette. Tilsett deretter 200 mikroliter trypsin per plate og virvle platen for å løsne de vedlagte cellene. Observer cellene under fasekontrastmikroskopi med et 4X-mål for å sikre at de har begynt å løsne.Deretter aspirerer ca 1,5 milliliter HC11 medium med en steril ni tommers Pasteur pipette og sprute den vertikalt mot cellene mens du roterer parabolen og sørger for å unngå sprut. Overfør alle cellene til flasken med HC11 medium og virvle for å spre jevnt i flasken. Deretter aliquot cellen suspensjon i 20 tre centimeter Petri retter ved å pipettering to milliliter celler per tallerken.Rock Petri retter for å spre cellene og inkubere dem på 37 grader Celsius og 5% karbondioksid over natten. På neste dag når cellene er 90 til 100% samløpet, aspirerer mediet og erstatter det med medium med FBS, men uten EGF. Etter å ha dyrket cellene i medium uten EGF i 24 timer, legg differensieringsmediet til 10 retter og vokse cellene i opptil 10 dager for å holde de andre 10 rettene som kontroller.Endre mediet hver to til tre dager med både HIP behandlet og kontrollceller. For å overvåke differensieringen, observere cellene med fasekontrast mikroskopi. Bruk fluorescensmikroskopi hvis cellene uttrykker grønt fluorescerende protein.I tillegg kvantifiserer graden av differensiering ved å trekke ut proteiner fra HIP behandlet og kontrollere celler en gang per dag og utføre Western Blot analyse. Samle og plasser EpH4 vekstmedium, EHS matrise, og to koniske 50 milliliter rør på is. Prechill vev kultur plater med pipette tips på minus 20 grader Celsius og forberede EpH4 vekst medium supplert med 10 eller 20% matrise i to 50 milliliter koniske rør og holde dem på is til klar til bruk.Etter å ha hentet de prechilled vev kultur plater på minus 20 grader Celsius, pels 10 brønner av 24-brønner plate med 150 mikroliter av ufortynnet matrise ved å spre matrisen med en pipette. Unngå å lage bobler når du sprer matrisen. Deretter trykker du forsiktig på sidene av platen og inkuberer platen ved 37 grader Celsius i en time for å la matrisen stivne.I mellomtiden, forberede differensiering ved å prøvepsinisering EpH4 cellene samt tidligere beskrevet og sikre encelledepensjoner etter resuspensjon av trypsiniserte celler. Deretter teller cellene i suspensjon med et hemocytometer. Overfør fem ganger 10 til de fire cellene per brønn til en 1,5 milliliter steril konisk sentrifuge rør og spinne dem på 250 ganger g i fem minutter.Aspirer forsiktig det overnaturlige mediet og legg røret på isen. Bruk en en milliliter pipettespiss til å gjenbruke cellene i 350 mikroliter eph4 vekstmedium supplert med 20% matrise samtidig som rørene på isen sørger for å unngå bobler. Når det nederste laget har størknet, legg til 350 mikroliter cellefjæring til hver belagt godt og legg den i en karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i en time for å la 20% matriselaget størkne.Vær oppmerksom på cellene med fasekontrastmikroskopi for å sikre at enkeltceller er synlige. Tilsett deretter 200 mikroliter EpH4 medium med 10% matrise på toppen og inkuber platen ved 37 grader Celsius. Begynn differensieringsinduksjon en dag etter plating cellene i matrisen.Fjern forsiktig 150 mikroliter av topp 10% matrisemedium og legg til 200 mikroliter EpH4-medium som inneholder HIP og 10%matrix, og for kontroller legger du til et 10% matrisemedium uten HIP. Bytt ut mediet annenhver dag i opptil 10 dager ved overvåking av mammospheredannelse med fasekontrastmikroskopi. For å kvantifisere differensieringen, pipette forsiktig av 10% matrix HIP medium fra brønnene og skyll 20% matriselaget med 350 mikroliter iskald PBS.Tilsett deretter 70 til 100 mikroliter iskald PBS med en millimolar EDTA direkte inn i brønnene og løsne forsiktig det nederste laget på 100% matrise med en pipettespiss. Rist platen forsiktig ved fire grader Celsius i 30 minutter. Overfør sfæroid suspensjonen forsiktig til et konisk rør og skyll brønnene med 500 mikroliter PBS EDTA for å gjenopprette eventuelle gjenværende sfæroider.Rock røret på isen i ytterligere 30 minutter, og pass på at matrisen er helt oppløst. Hvis synlige matriseklumper ses, legg til mer PBS EDTA eller rist lenger. Sentrifuger oppløsningen på 350 ganger g for å pellet spheroidene.Deretter aspirerer du overnatanten, lyse spheroidene, og sonder cellene for beta-kasein, cyclin D1 og p120RasGAP ved vestlig blotting. Det er en slående avhengighet av differensiering på styrken av Rac signalet i HC11 celler. Mens endogene CRAC1 er nødvendig for differensiering og lave nivåer av mutasjonsaktivert RacV12 forårsake en økning i differensieringskapasitet, utløser høye RacV12-nivåer en blokk med differensiering og induserer neoplasi.Når differensieringsegenskapene til EpH4-celler ble utforsket i en 3D-matrisekultur, ble det funnet at beta-kaseinproduksjonen nådde åtte til 10 dager og cyklin D1-uttrykket var maksimalt på fire til seks dager etter HIP-stimulering. For å bestemme plasseringen av individuelle celler, ble de farget med DAPI og avbildet med konfokal mikroskopi. Indre celledød og dannelse av hule lumen ble observert i mammospheres mens tilsetning av HGF resulterte i dannelsen av rørformede strukturer.Noen som utfører denne teknikken for første gang bør huske på at plating av HC11 cellene er viktig. Også riktig ekstraksjon av EpH4-cellene fra matrisen er avgjørende for proteinmengde fordi eventuelle rester vil påvirke proteinbestemmelsen. Denne teknikken kan brukes til å undersøke andre signaltransdusere som kan oppføre seg på en lignende måte.Hvis det er drivermutasjoner i en kreft, vil deres fullstendige hemming ikke være nødvendig siden lave nivåer igjen faktisk ville indusere differensiering.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Syntese og karakterisering av en Aspirin-fumarat Prodrog at Hemmer NFkB Aktivitet og brystkreft stamceller

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Opptreden av humane brystcancerceller i Embryonic Sebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-imaging av brystet Epithelial celle migrasjon etter forbigående uttømming av TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Orthotopic injeksjon av brystkreft celler i mus Mammary fett puten

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modellering brystkreft via en intraductal injeksjon av grobunn-uttrykker Adenovirus inn i mus bryst kjertel

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Vurderer differensiering kapasitet på Mouse prostata epitelceller bruke Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Ortotopisk transplantasjon av brystsvulster som prekliniske modeller for brystkreft

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funksjonell vurdering av humane brystkreftstamceller fra celle- og vevsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Studere TGF-β signalisering og TGF-β-indusert epitel-til-mesenchymal overgang i brystkreft og normale celler

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...