Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

A linha celular HC11 foi gentilmente fornecida pelo Dr. D. Medina (Houston, TX). Os autores são gratos ao Dr. Andrew Craig da Queen's University por muitos reagentes e sugestões valiosas. As células EpH4 foram um presente do Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick prestou excelente assistência técnica para estudos culturais 3D.
A assistência financeira do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC), dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), da Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontário Chapter), da Canadian Breast Cancer Research Alliance , os Centros de Excelência de Ontário, a Ação contra o Câncer de Mama Kingston (BCAK) e o fundo de legado Clare Nelson através de subsídios à LR são reconhecidos com gratidão. Be recebeu apoio de subvenção da CIHR, CBCF, BCAK e Cancer Research Society Inc. A PTG é apoiada por um presidente de pesquisa do Canadá, Fundação Canadense para Inovação, CIHR, NSERC e Canadian Cancer Society. MN foi apoiado por uma estudante do Terry Fox Training Program em Pesquisa Transdisciplinar de Câncer da NCIC, um prêmio de pós-graduação (QGA), e um Prêmio Reitor da Queen's University. Mg foi apoiado por bolsas de pós-doutorado do Programa de Câncer de Mama do Exército dos EUA, do Ministério da Pesquisa e Inovação da Província de Ontário e do Comitê de Pesquisa Consultiva da Universidade da Rainha. A VH foi apoiada por uma bolsa de doutorado da CBCF e uma bolsa de pós-doutorado do Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research em parceria com a CIHR. Hanad Adan foi o destinatário de uma estudante de verão da NSERC. BS foi apoiado por um prêmio de pós-graduação da Queen's University.

1. Plating HC11 Células
<ol><li>Em uma capa de fluxo laminar usando técnicas estéreis prepare uma garrafa com 50 mL de meio celular HC11: RPMI-1640 com soro bovino 10% fetal (FBS), 5 μg/mL insulina e 10 ng/mL EGF (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Prato aproximadamente 400.000 células por 3 cm Placa de petri: Passe duas placas de Petri de 10 cm e 50% em vinte pratos de 3 cm no meio HC11. As células devem estar bem espalhadas, mas a secagem deve ser evitada.<ol>
<li>Aspirar o meio em um frasco u...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

As células HC11 são idealmente adequadas para o estudo da diferenciação em conjunto com a transformação neoplástica. Uma vantagem adicional é que as células HC11 são facilmente infectáveis com vetores retrovirais baseados em Mo-MLV para expressar uma variedade de genes. Em nossas mãos, as células EpH4 eram mais difíceis de infectar com os mesmos vetores retrovirais do que o HC112.
Contato celular-celular e prisão de crescimento são pré-requisitos fundam...

Em tecidos normais ou tumores, as células têm extensas oportunidades de adesão aos seus vizinhos em uma organização tridimensional, e isso é imitado na cultura pelo crescimento celular de alta densidade. A adesão celular-célula é mediada principalmente através de receptores de cadherina, que definem arquitetura celular e tecidual. Curiosamente, foi demonstrado recentemente que os cadherins também desempenham um papel poderoso na transdução de sinais, especialmente na sinalização de sobrevivência1. Paradoxalmente, alguns desses sinais de adesão celular-célula emanando de cadherins foram recentemente encontrados para serem compartilhados tanto pela diferenciação quanto pela neoplasia2. Aqui, descrevemos métodos de indução e avaliação da diferenciação em dois tipos representativos de linhas celulares epiteliais do peito do camundongo, HC11 e EpH4.
A linha de células epiteliais do camundongo HC11 pode fornecer um modelo útil para o estudo da diferenciação celular epitelial. As células HC11 são uma linha celular derivada comma-1D, originária da glândula mamária de um rato Balb/c grávidamédia 3. Em contraste com outros clones derivados COMMA-1D, o clone do HC11 não tem exigência para matriz extracelular exógena adicionada ou cocultivo com outros tipos de células para a indução in vitro do gene de β-casein endógeno por hormônios lactogênicos3. Esta linha celular tem sido amplamente utilizada em estudos de diferenciação porque manteve características importantes do epitélio mamário normal: as células HC11 podem reconstituir parcialmente o epitélio ductal em uma almofada de gordura mamária limpa4. Além disso, eles podem diferenciar em uma cultura bidimensional (2D) quando cultivadas para confluência anexada a uma superfície de placa de Petri de plástico na presença de um esteroide como h ydrocortisona ou Dexamethasone, além de Insulin e Prolactin (meio HIP) sem fator de crescimento epidérmico (EGF), um inibidor de diferenciação5,6,7. Nessas condições, as células HC11 produzem proteínas lácteas, como β-caseína e WAP, que são detectáveis pela coagulação ocidental dentro de 4 dias após a indução. Ao mesmo tempo, uma parte das células HC11 forma estruturas rudimentares de glândulas mamárias denominadas "cúpulas" de forma estocástica. As cúpulas são visíveis de 4 a 5 dias após a indução e aumentam gradualmente de tamanho até o dia 10, concomitantes com um aumento na produção de β-casein8. Curiosamente, as células HC11 possuem mutantes p539, e, portanto, representam um estado préneoplástico. Por essa razão, o modelo HC11 é ideal para estudar redes de sinalização de diferenciação em conjunto com a neoplasia no mesmo sistema celular.
As células EpH4, um derivado das células IM-2, são uma linha celular não tumorigênica originalmente derivada de células epiteliais de glândula mamárias de camundongos espontaneamente imortalizadas isoladas de um rato Balb/c grávida10. As células EpH4 formam monocamadas epiteliais contínuas na cultura 2D, mas não se diferenciam em estruturas semelhantes a glandular10,11. No entanto, após o crescimento 3D em um material composto por uma mistura de proteínas matrica extracelulares produzidas pelas células de sarcoma do camundongo EHS12 (matriz, matriz ou Matrigel, ver Tabela de Materiais),além de estimulação com quadril, as células EpH4 podem recapitular os estágios iniciais da diferenciação da glândula mamária. Nessas condições, as células EpH4 formam esferoides (também chamados de mamografias) que exibem polaridade apical-basal e um lúmen oco, e são capazes de produzir as proteínas do leite β-caseína e WAP, semelhantes às células epiteliais mamárias lactantes. Ao contrário das células HC11, que são indiferenciadas, e algumas expressam marcadores mesenquimicos13,as células EpH4 exibem uma morfologia puramente luminal14. As células EpH4 também foram relatadas para produzir proteínas leiteres na cultura 2D através da estimulação com dexametasona, insulina e prolactina15. No entanto, essa abordagem impede o estudo de efeitos regulatórios que imitam o microambiente da glândula mamária na cultura 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Cadherins desempenham um papel importante na regulação da diferenciação celular, bem como da neoplasia. Aqui descrevemos as origens e métodos da indução da diferenciação de duas linhas de células epiteliais do peito de camundongo, HC11 e EpH4, e seu uso para estudar estágios complementares de desenvolvimento de glândulas mamárias e transformação neoplástica.
A linha de células epiteliais do camundongo HC11 originou-se da glândula mamária de um rato Balb/c grávida. Diferencia-se quando cultivado à confluência anexada a uma superfície de placa de Petri de plástico em meio contendo soro fetal de bezerro e ydrocortisona H, insulin e Prolactin (meio QUADRIL). Nessas condições, as células HC11 produzem as proteínas de β-caseína e soroácido soro (WAP), semelhantes às células epiteliais mamárias lactantes, e formam estruturas rudimentares de glândulam mamárias denominadas "cúpulas".
A linha celular EpH4 foi derivada de células epiteliais de glândula samárias de camundongos espontaneamente imortalizadas isoladas de um rato Balb/c grávida. Ao contrário do HC11, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente em esferoides (também chamados de mamografias) quando cultivadas condições tridimensionais (3D) de crescimento no meio HIP. As células são trippsinizadas, suspensas em uma matriz de 20% composta por uma mistura de proteínas matrica extracelulares produzidas pelas células de sarcoma de camundongos Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), banhadas em cima de uma camada de matriz concentrada que reveste uma placa de Petri de plástico ou placa multiwell, e coberta com uma camada de 10% de matricial contendo meio HIP. Nessas condições, as células EpH4 formam esferoides ocos que exibem polaridade apical-basal, um lúmen oco, e produzem β-caseína e WAP.
Utilizando essas técnicas, nossos resultados demonstraram que a intensidade do sinal cadherin/Rac é fundamental para a diferenciação das células HC11. Embora rac1 seja necessário para diferenciação e baixos níveis de RacV12 ativado aumentam a diferenciação, altos níveis de RacV12 bloqueiam diferenciação ao induzir neoplasia. Em contraste, as células EpH4 representam um estágio anterior na diferenciação epitelial mamária, que é inibida por níveis ainda baixos de RacV12.

Há muito se sabe que a diferenciação de células epiteliais e adipócitos requer confluência e engajamento de cadherins2. Nós e outros demonstramos que a adesão celular-célula e o engajamento de E- ou N-cadherin e cadherin-11, como ocorre com a confluência das células cultivadas, desencadeia um aumento dramático na atividade do pequeno GTPases Rac e da proteína de controle da divisão celular 42 (Cdc42), e esse processo leva à ativação de citocinas familiares interleucinas-6 (IL6) e ...

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Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Descrevemos técnicas de indução de diferenciação de duas linhas epiteliais mamárias, HC11 e EpH4. Embora ambos exijam soro fetal, insulina e prolactina para produzir proteínas lácteas, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente das mamografias na cultura tridimensional. Esses modelos complementares são úteis para estudos de transdução de sinal de diferenciação e neoplasia.

Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

As células HC11 e EpH4 são linhas de células epiteliais de mama do rato que podem se diferenciar na cultura. Ao mesmo tempo, essas células podem ser transformadas por uma série de oncogenes. Essas células são ideais para o estudo da inter-relação entre diferenciação e transformação neoplásica.Essas técnicas podem ser usadas em estudos de transdução de sinais para descobrir alvos para a terapia do câncer. Por exemplo, o pequeno GTPase Rac e outras moléculas podem desencadear a transformação de células epiteliais mamárias quando expressas em níveis elevados, mas surpreendentemente em níveis baixos, elas podem induzir diferenciação. Outros transdutores de sinal podem se comportar de maneira semelhante.Os princípios podem se aplicar a outros tipos de diferenciação, bem como onde a confluência celular desempenha um papel importante, por exemplo, a diferenciação de adipócitos ou miotubes. Alguém que execute essa técnica pela primeira vez deve ter em mente que o revestimento das células HC11 é importante. Isso porque o contato celular-celular é importante para a diferenciação.Outro ponto a ser observado é que a extração adequada de células EpH4 da matriz é fundamental para a quantitação proteica, pois quaisquer resíduos afetarão a determinação da proteína. A demonstração visual deste método é útil porque alguns detalhes do protocolo são difíceis de descrever no papel. Comece preparando uma garrafa de 50 mililitros de meio celular HC11 de acordo com as instruções do manuscrito.Para emplacar as células, aspire o meio a partir de cinco placas petri 50% confluentes de seis centímetros e lave as células com aproximadamente 1,8 mililitros de trippsina usando uma pipeta Pasteur plugada de algodão de nove polegadas estéril. Em seguida, adicione 200 microliters de trippsina por placa e gire a placa para desalojar as células anexadas. Observe as células em fase de microscopia de contraste com um objetivo 4X para garantir que elas começaram a se desalojar.Em seguida, aspire aproximadamente 1,5 mililitros de meio HC11 com uma pipeta Pasteur estéril de nove polegadas e esguichar verticalmente contra as células enquanto gira o prato certificando-se de evitar respingos. Transfira todas as células para a garrafa com meio HC11 e redemoinho para dispersar uniformemente na garrafa. Em seguida, aliquot a suspensão celular em 20 placas de Petri de três centímetros, pipetando dois mililitros de células por prato.Balance as placas de Petri para espalhar as células e incuba-las a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, quando as células estiverem 90 a 100% confluentes, aspire o meio e substitua-o por médio por FBS, mas sem EGF. Depois de cultivar as células em médio sem EGF por 24 horas, adicione o meio de diferenciação a 10 pratos e cresça as células por até 10 dias mantendo os outros 10 pratos como controles.Troque o meio a cada dois ou três dias com células tratadas e controladas pelo HIP. Para monitorar a diferenciação, observe as células com microscopia de contraste de fase. Use microscopia de fluorescência se as células estiverem expressando proteína fluorescente verde.Além disso, quantifique o grau de diferenciação extraindo proteínas das células tratadas e controladas pelo HIP uma vez por dia e realizando a análise do Western Blot. Reúna e coloque o meio de crescimento EpH4, a matriz EHS, e dois tubos cônicos de 50 mililitros no gelo. Prechill as placas de cultura tecidual com pontas de pipeta a menos 20 graus Celsius e prepare o meio de crescimento EpH4 complementado com matriz de 10 ou 20% em dois tubos cônicos de 50 mililitros e mantê-los no gelo até estar pronto para usar.Depois de recuperar as placas de cultura de tecido pré-estilhaçadas a menos 20 graus Celsius, cubra 10 poços da placa de 24 poços com 150 microliters de matriz não diluída espalhando a matriz com uma pipeta. Evite criar bolhas ao espalhar a matriz. Em seguida, bata suavemente nas laterais da placa e incubar a placa a 37 graus Celsius durante uma hora para permitir que a matriz se solidifique.Enquanto isso, prepare-se para a diferenciação, experimentando as células EpH4, bem como descrito anteriormente e garantindo suspensões de células únicas após a ressuspensão de células experimentpsinizadas. Em seguida, conte as células em suspensão com um hemótmetro. Transfira cinco vezes 10 para as quatro células por poço para um tubo de centrífuga cônica estéril de 1,5 mililitro e gire-os a 250 vezes g por cinco minutos.Aspire cuidadosamente o meio supernante e coloque o tubo no gelo. Use uma ponta de pipeta de um mililitro para resuspensar as células em 350 microliters de meio de crescimento EpH4 complementados com matriz de 20%, mantendo os tubos no gelo certificando-se de evitar bolhas. Uma vez que a camada inferior tenha se solidificado, adicione os 350 microliters de suspensão celular a cada poço revestido e coloque-o em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora para permitir que a camada de matriz de 20% se solidifique.Observe as células com microscopia de contraste de fase para garantir que as células únicas sejam visíveis. Em seguida, adicione 200 microliters de meio EpH4 com matriz de 10% em cima e incubar a placa a 37 graus Celsius. Comece a indução de diferenciação um dia depois de emplacar as células na matriz.Remova cuidadosamente 150 microliters de meio de matriz superior de 10% e adicione 200 microliters de meio EpH4 contendo HIP e matriz de 10% e para controles adicione um meio de matriz de 10% sem HIP. Substitua o meio a cada dois dias por até 10 dias monitorando a formação da mamografia por microscopia de contraste de fase. Para quantificar a diferenciação, pipeta cuidadosamente fora do meio HIP de matriz de 10% dos poços e enxágue a camada de matriz de 20% com 350 microliters de PBS gelado.Em seguida, adicione 70 a 100 microliters de PBS gelado com um EDTA milimola diretamente nos poços e desprende suavemente a camada inferior de matriz de 100% com uma ponta de pipeta. Agite a placa suavemente a quatro graus Celsius por 30 minutos. Transfira cuidadosamente a suspensão esféide para um tubo cônico e enxágue os poços com 500 microliters de PBS EDTA para recuperar quaisquer esferoides restantes.Balance o tubo no gelo por mais 30 minutos, certificando-se de que a matriz se dissolve totalmente. Se forem vistas aglomerações de matriz visível, adicione mais PBS EDTA ou agite mais tempo. Centrifugar a solução a 350 vezes g para pellet os esferoides.Em seguida, aspire o supernasciente, lise os esferoides, e teste as células para beta-caseína, cíclin D1 e p120RasGAP por manchas ocidentais. Há uma dependência impressionante da diferenciação sobre a força do sinal Rac nas células HC11. Enquanto crac1 endógeno é necessário para diferenciação e baixos níveis de RacV12 ativados mutacionáriamente causam um aumento na capacidade de diferenciação, altos níveis de RacV12 desencadeiam um bloco de diferenciação e induzem neoplasia.Quando as propriedades de diferenciação das células EpH4 foram exploradas em uma cultura de matriz 3D, descobriu-se que a produção de beta-caseína atingiu o pico de oito a dez dias e a expressão cyclin D1 foi máxima em quatro a seis dias após a estimulação do QUADRIL. Para determinar o posicionamento de células individuais, elas foram manchadas com DAPI e imagens com microscopia confocal. A morte celular interna e a formação de lúmens ocos foram observadas nas mammosféricas, enquanto a adição de HGF resultou na formação de estruturas tubulares.Alguém que execute essa técnica pela primeira vez deve ter em mente que o revestimento das células HC11 é importante. Também a extração adequada das células EpH4 da matriz é fundamental para a quantitação proteica, pois quaisquer resíduos afetarão a determinação da proteína. Esta técnica pode ser usada para investigar outros transdutores de sinal que podem se comportar de forma semelhante.Se houver mutações de driver em um câncer, então sua inibição completa não será necessária, uma vez que baixos níveis restantes realmente induziriam a diferenciação.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Síntese e Caracterização de um pró-fármaco Aspirina-fumarato que inibe a actividade NFkB e da mama câncer de células estaminais

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Pesquisa do câncer

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Imagens ao vivo de migração de células epiteliais da mama após o esgotamento de transiente de TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modelagem de câncer de mama através de uma injeção intraductal de CRE-expressando Adenovirus na glândula mamária do mouse

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...