Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

Линия клеток HC11 была любезно предоставлена доктором Д. Мединой (Хьюстон, Техас). Авторы благодарны доктору Эндрю Крейгу из Королевского университета за множество реагентов и ценных предложений. Клетки EpH4 были подарком от доктора C. Roskelley (UBC, Ванкувер). Коллин Шик оказала отличную техническую помощь для 3D-культуры исследований.
Финансовая помощь Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC), Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR), Канадского фонда рака молочной железы (CBCF, Онтарио Глава), Канадского альянса исследований рака молочной железы , Онтарио Центры передового опыта, рака молочной железы действий Кингстон (BCAK) и Клэр Нельсон завещание фонда через гранты LR с благодарностью признается. BE получил грантовую поддержку от CIHR, CBCF, BCAK и онкологических исследований общества Инк PTG поддерживается Канады научно-исследовательский председатель, Канадский фонд инноваций, CIHR, NSERC и Канадского онкологического общества. MN была поддержана студентом из Терри Фокс Учебная программа в transdisciplinary исследований рака от NCIC, Высшей премии (ЗГА), и премия декана от Университета королевы. MG была поддержана постдокторской стипендий от армии США рака молочной железы программы, Министерство исследований и инноваций провинции Онтарио и Консультативный исследовательский комитет Королевского университета. VH была поддержана докторской стипендией CBCF и постдокторской стипендией от Программы обучения Фонда Терри Фокса в области трансдисциплинарных онкологических исследований в партнерстве с CIHR. Ханад Адан был получателем летнего обучения NSERC. BS была поддержана наградой выпускника Королевского университета.

1. Покрытие hC11 Клетки
<ol><li>В ламинарном капоте с использованием стерильных методов подготовить бутылку с 50 мл Среды клетки HC11: RPMI-1640 с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 5 мкг/мл инсулина, и 10 нг/мл EGF (см. Таблица материалов).</li>
	<li>Плита приблизительно 400,000 клеток в 3 см ...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

Клетки HC11 идеально подходят для изучения дифференциации в сочетании с неопластической трансформацией. Дополнительным преимуществом является то, что клетки HC11 легко заражаются ретровирусными вектором на основе Mo-MLV для выражения различных генов. В наших руках клетки EpH4 было труднее за...

В нормальных тканях или опухолях клетки имеют широкие возможности для примыкания к своим соседям в трехмерной организации, и это передразняется в культуре высоким ростом клеток плотности. Клеточная стежка опосредована главным образом через рецепторы кадерин, которые определяют архитектуру клеток и тканей. Интересно, что недавно было продемонстрировано, что кадерины также играют важную роль в трансдукции сигналов, особенно в выживании сигнализации1. Парадоксально, но некоторые из этих клеточных стыковочных сигналов, исследующих из кадерин, были недавно найдены общими как дифференциации и неоплазии2. Здесь мы описываем методы индукции и оценки дифференциации в двух представительных типах эпителиальных клеточных линий молочной железы мыши, HC11 и EpH4.
Линия эпителиальной клеточной линии мыши HC11 может стать полезной моделью для изучения дифференциации эпителиальных клеток. Клетки HC11 являются comMA-1D-производные клеточной линии, происходящих из молочной железы в середине беременной Balb / c мыши3. В отличие от других производных клонов COMMA-1D, клон HC11 не требует экзогенно добавленной внеклеточной матрицы или кокультивации с другими типами клеток для индукции в пробирке эндогенного гена эндогенного гена лактогенными гормонами3. Эта клеточная линия была широко использована в исследованиях дифференциации, потому что она сохранила важные характеристики нормального эпителия молочной железы: клетки HC11 могут частично воссоздать протоковый эпителий в очищенной молочной жирной площадке4. Кроме того, они могут дифференцировать в двумерной (2D) культуры, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности блюда Петри в присутствии стероидов,таких как Hydrocortisone или Дексаметазон, в дополнение к Insulin и Prolactin (HIP средний) не хватает эпидермального фактора роста (EGF), ингибитор дифференциации5,6. В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки, такие как к-казеин и WAP, которые обнаруживаются западными промотированием в течение 4 дней после индукции. В то же время, часть клеток HC11 образует рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами» в стохастической манере. Куполы видны через 4-5 дней после индукции и постепенно увеличиваются в размерах до 10-го дня, что сопутствует увеличению производства к-казеина8. Интересно, что клетки HC11 обладают мутантом p539,и поэтому представляют собой преднеопластическое состояние. По этой причине модель HC11 идеально подходит для изучения сигнальных сетей дифференциации в сочетании с неоплатой в одной и той же клеточной системе.
Клетки EpH4, производные im-2 клеток, являются неопухолевой клеточной линии первоначально полученных от спонтанно увековеченных мыши молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от середины беременности Balb / C мыши10. Клетки EpH4 образуют непрерывные эпителиальные монослои в 2D-культуре, но не дифференцируются в железоподобные структуры10,11. Однако, после 3D роста в материале, состоящем из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши EHS12 (EHS matrix, matrix, или Matrigel, см. Таблица Материалов),в дополнение к стимуляции с HIP, epH4 клетки могут резюмировать начальные стадии дифференциации молочной железы. В этих условиях клетки EpH4 образуют сфероиды (также называемые маммосферами), которые демонстрируют апикально-базальную полярность и полый просвет, и способны производить молочные белки и WAP, похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы. В отличие от клеток HC11, которые являются недифференцированными, а некоторые выражают мезенхимальные маркеры13,клетки EpH4 демонстрируют чисто светлую морфологию14. EpH4 клетки также сообщалось производить молочные белки в 2D культуры путем стимуляции с дексаметазоном, инсулином и пролактином15. Однако такой подход исключает изучение регулятивных эффектов, имитирующих микросреду молочной железы в 3D-культуре.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Кадхерины играют важную роль в регулировании дифференциации клеток, а также неоплазии. Здесь мы описываем происхождение и методы индукции дифференциации двух линий эпителиальной клеточной клетки молочной железы, HC11 и EpH4, а также их использование для изучения дополнительных этапов развития молочной железы и неопластической трансформации.
Линия эпителиальной клеточной клетки мышки HC11 возникла из молочной железы беременной мыши Balb/c. Он дифференцируется, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности чашки Петри в среде, содержащей сыворотки икроножной железы плода и Hydrocortisone, Insulin и Prolactin (HIP среды). В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки и сывороточный кислотный белок (WAP), похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы, и образуют рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами».
Линия клеток EpH4 была получена из спонтанно увековеченных мышей молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от беременной бальзам / c мыши. В отличие от HC11, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в сфероиды (также называемые маммосферы), когда культивируется в трехмерных (3D) условиях роста в среде HIP. Клетки трипсинизированы, подвешены в 20% матрице, состоящей из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), покрынные поверх слоя концентрированной матрицы, покрывающей пластиковую тарелку Петри или многоцветную пластину, и покрытые слоем 10% матрицы, содержащей HIP среду. В этих условиях клетки EpH4 образуют полые сфероиды, которые демонстрируют апикально-базальную полярность, полый просвет, и производят к-казеин и WAP.
Используя эти методы, наши результаты показали, что интенсивность сигнала cadherin/Rac имеет решающее значение для дифференциации клеток HC11. В то время как Rac1 необходим для дифференциации и низких уровней активированного RacV12 увеличить дифференциацию, высокие уровни RacV12 блокируют дифференциацию, вызывая неоплазию. В отличие от этого, клетки EpH4 представляют собой более раннюю стадию в дифференциации эпителии молочной железы, которая тормозится даже низким уровнем RacV12.

Давно известно, что дифференциация эпителиальных клеток и адипоцитов требует слияния и вовлечения кадерин2. Мы и другие продемонстрировали, что сливка от клетки к ячейке и вовлечение E- или N-кадерин и кадхерин-11, как происходит с слиянием культивированных клеток, вызывает р...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Мы описываем методы индукции двух эпителиальных линий молочной железы, HC11 и EpH4. В то время как оба требуют сыворотки плода теленка, инсулина и пролактина для производства молочных белков, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в маммосферы в трехмерной культуре. Эти дополнительные модели полезны для исследований трансдукции сигналов дифференциации и неоплазии.

Дифференциация мышиной груди Эпителиальная HC11 и EpH4 клетки

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Клетки HC11 и EpH4 являются линиями эпителиальных клеток молочной железы мыши, которые могут различаться в культуре. В то же время, эти клетки могут быть преобразованы рядом онкогенов. Эти клетки идеально подходят для изучения взаимосвязи между дифференциацией и неопластической трансформацией.Эти методы могут быть использованы в исследованиях трансдукции сигнала, чтобы обнаружить цели для терапии рака. Например, небольшой GTPase Rac и другие молекулы могут вызвать трансформацию эпителиальных клеток молочной железы при выраженных до высоких уровней, но удивительно на низких уровнях, они могут вызвать дифференциацию. Другие превью сигнала могут вести себя аналогичным образом.Принципы могут применяться к другим видам дифференциации, а также, где слияние клеток играет важную роль, например дифференциации адипоцитов или миотрубов. Кто-то выполняет этот метод в первый раз следует иметь в виду, что покрытие клеток HC11 имеет важное значение. Это потому, что контакт от клетки к клетке имеет важное значение для дифференциации.Еще один момент, чтобы следить за тем, что надлежащее извлечение клеток EpH4 из матрицы имеет решающее значение для количественной оценки белка, потому что любые остатки будут влиять на определение белка. Визуальная демонстрация этого метода полезна, поскольку некоторые детали протокола трудно описать на бумаге. Начните с подготовки бутылки из 50 миллилитров клеточной среды HC11 в соответствии с рукописными указаниями.Чтобы пластины клеток, аспирировать среды от пяти шести сантиметров 50% confluent Петри блюда и мыть клетки с примерно 1,8 миллилитров трипсина с помощью стерильных девять дюймов хлопка подключен Пастер пипетки. Затем добавьте 200 микролитров трипсина на тарелку и закружить пластину, чтобы выбить прикрепленные клетки. Наблюдайте за клетками под фазовой контрастной микроскопией с целью 4X, чтобы убедиться, что они начали вытеснять.Затем аспирировать примерно 1,5 миллилитров HC11 среды со стерильным девять дюймов Пастер пипетки и шприц его вертикально против клеток, вращая блюдо убедившись, чтобы избежать брызг. Перенесите все клетки в бутылку со средним HC11 и вихрем, чтобы равномерно разойтись в бутылке. Затем aliquot клеточной подвески в 20 трех сантиметров Петри блюда путем трубопроводов два миллилитров клеток на блюдо.Рок Петри блюда для распространения клеток и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в одночасье. На следующий день, когда клетки на 90-100% стекут, аспирировать среду и заменить ее средой с FBS, но без EGF. После выращивания клеток в среде без EGF в течение 24 часов, добавить дифференциации среды до 10 блюд и расти клетки до 10 дней, сохраняя другие 10 блюд в качестве контроля.Изменение среды каждые два-три дня как с HIP лечение и контрольных клеток. Чтобы контролировать дифференциацию, наблюдайте за клетками с фазовой контрастной микроскопией. Используйте микроскопию флуоресценции, если клетки выражают зеленый флуоресцентный белок.Кроме того, количественно степень дифференциации путем извлечения белков из HIP лечение и контроль клеток один раз в день и выполнения западного анализа пятно. Соберите и поместите среду роста EpH4, матрицу EHS и две конические 50 миллилитровые трубки на льду. Prechill ткани культуры пластин с пипеткой советы при температуре минус 20 градусов по Цельсию и подготовить EpH4 среднего роста дополняется 10 или 20%matrix в двух 50 миллилитров конических труб и держать их на льду до готовности к использованию.После извлечения предварительно облицованной ткани культуры пластин при температуре минус 20 градусов по Цельсию, пальто 10 скважин 24-хорошо пластины с 150 микролитров неразбавленной матрицы путем распространения матрицы с пипеткой. Избегайте создания пузырьков при распространении матрицы. Затем осторожно коснитесь стороны пластины и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы матрица затвердеть.Между тем, подготовиться к дифференциации путем трипсинизации клеток EpH4, а также ранее описанных и обеспечения одноклеточных суспензий после повторного незаменимия трипсинизированных клеток. Далее подсчитайте клетки в подвеске с гемоцитометром. Передача пять раз 10 до четырех клеток на колодец в 1,5 миллилитров стерильной конической центрифуги трубки и спина их в 250 раз г в течение пяти минут.Тщательно аспирировать супернатант среды и поместить трубку на лед. Используйте один миллилитровый наконечник пипетки, чтобы повторно использовать клетки в 350 микролитров epH4 среды роста дополняется 20%матрицы, сохраняя трубы на льду убедившись, чтобы избежать пузырьков. После того, как нижний слой затвердеет, добавьте 350 микролитров клеточной подвески к каждому покрытой хорошо и поместите его в инкубатор двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы 20%-матричный слой затвердеть.Наблюдайте за клетками с фазовой контрастной микроскопией, чтобы убедиться, что отдельные клетки видны. Затем добавьте 200 микролитров среды EpH4 с 10%матрицей сверху и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию. Начните индукцию дифференциации через день после покрытия клеток в матрице.Аккуратно удалите 150 микролитров верхней 10%матрицы среды и добавьте 200 микролитров среды EpH4, содержащих HIP и 10%matrix, а для элементов управления добавьте 10%-среду без HIP. Замените носитель каждые два дня на срок до 10 дней, отслеживая образование маммосферы фазовой контрастной микроскопией. Для количественной оценки дифференциации, тщательно пипетки от 10%матрицы HIP среды из скважин и промыть 20%матричный слой с 350 микролитров ледяной PBS.Затем добавьте от 70 до 100 микролитров ледяного PBS с одним миллимолярной ЭДТА непосредственно в скважины и аккуратно отсоедините нижний слой 100%-процентной матрицы кончиком пипетки. Встряхните тарелку осторожно при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут. Тщательно перенесите суспензию сфероида в коническую трубку и промойте скважины 500 микролитров PBS EDTA, чтобы восстановить оставшиеся сфероиды.Рок трубки на льду в течение еще 30 минут убедившись, что матрица полностью растворяется. Если видные сгустки матрицы видны, добавить больше PBS EDTA или встряхнуть дольше. Центрифуга раствора в 350 раз г гранулировать сфероиды.Затем аспирировать супернатант, лизировать сфероиды, и зондировать клетки для бета-кейсина, циклина D1, и p120RasGAP западным blotting. Существует поразительная зависимость дифференциации от силы сигнала Rac в клетках HC11. В то время как эндогенный CRAC1 необходим для дифференциации и низкие уровни мутационно активированного RacV12 вызывают увеличение дифференциации, высокие уровни RacV12 вызывают блок дифференциации и вызывают неоплазию.Когда свойства дифференциации клеток EpH4 были исследованы в культуре 3D матрицы, было установлено, что производство бета-кейсина достигло пика в 8-10 дней, а экспрессия циклина D1 была максимальной через четыре-шесть дней после стимуляции HIP. Чтобы определить позиционирование отдельных клеток, они были окрашены DAPI и изображены с конфокальные микроскопии. Внутренняя гибель клеток и образование полых люменов наблюдалось в маммосферах, а добавление HGF приводило к образованию трубчатых структур.Кто-то выполняет этот метод в первый раз следует иметь в виду, что покрытие клеток HC11 имеет важное значение. Также правильное извлечение клеток EpH4 из матрицы имеет решающее значение для количественной оценки белка, потому что любые остатки повлияют на определение белка. Этот метод может быть использован для исследования других превью сигнала, которые могут вести себя аналогичным образом.Если есть мутации драйвера в раке, то их полное ингибирование не будет необходимости, так как низкие уровни, оставшиеся на самом деле вызовет дифференциацию.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Синтез и характеристика аспирином-фумарата пролекарственного соединения, которое угнетает NFκB активность и рак молочной железы стволовых клеток

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Инвазивные поведение клеток рака молочной железы человека в эмбриональном данио рерио

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Жить изображений миграции эпителиальных клеток молочной железы после переходных истощение TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Ортотопическая инъекции клеток рака молочной железы в мышей молочной железы жировой ткани

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Моделирование рака молочной железы с помощью интрадуктальной инъекции Cre-выражения аденовируса в мышь mammary Gland

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Оценка дифференциации потенциала мыши простаты эпителиальных клеток с использованием органоидной культуры

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Ортотопическая трансплантация опухолей молочной железы как доклинические модели рака молочной железы

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Выделение и функциональная оценка стволовых клеток рака молочной железы человека из образцов клеток и тканей

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Изучение TGF-β сигнализации и TGF-β индуцированных Эпителиальный к мезенхимальный переход в рак молочной железы и нормальных клеток

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...