Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

La línea celular HC11 fue proporcionada amablemente por el Dr. D. Medina (Houston, TX). Los autores están agradecidos al Dr. Andrew Craig de queen's University por muchos reactivos y valiosas sugerencias. Las células EpH4 fueron un regalo del Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick proporcionó una excelente asistencia técnica para estudios de cultivo 3D.
La asistencia financiera del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR), la Fundación Canadiense contra el Cáncer de Mama (CBCF, Capítulo de Ontario), la Alianza Canadiense para la Investigación del Cáncer de Mama , se reconocen con gratitud los Centros de Excelencia de Ontario, el Kingston de Acción contra el Cáncer de Mama (BCAK) y el fondo de legado Clare Nelson a través de subvenciones a LR. BE recibió apoyo de CIHR, CBCF, BCAK y Cancer Research Society Inc. PTG cuenta con el apoyo de una Cátedra de Investigación de Canadá, la Fundación Canadiense para la Innovación, el CIHR, el NSERC y la Sociedad Canadiense del Cáncer. MN fue apoyado por una estudiante del Programa de Entrenamiento Terry Fox en Investigación Transdisciplinaria del Cáncer de NCIC, un Premio de Posgrado (QGA), y un Premio Dean de la Universidad de Queen. MG fue apoyada por becas postdoctorales del Programa de Cáncer de Mama del Ejército de los Estados Unidos, el Ministerio de Investigación e Innovación de la Provincia de Ontario y el Comité Asesor de Investigación de la Universidad de Queen. VH contó con el apoyo de una beca de doctorado CBCF y una beca postdoctoral del Programa de Capacitación de la Fundación Terry Fox en Investigación Transdisciplinaria del Cáncer en asociación con la CIHR. Hanad Adan fue el receptor de una beca de verano NSERC. La licenciatura fue apoyada por un premio de posgrado de la Universidad de la Reina.

1. Placado de células HC11
<ol><li>En una campana de flujo laminar utilizando técnicas estériles, prepare un frasco con 50 ml de medio celular HC11: RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS), insulina de 5 g/ml y EGF de 10 ng/ml (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Placa de aproximadamente 400.000 celdas por plato Petri de 3 cm: Pasar dos platos Petri de 10 cm, 50% confluentes en veinte platos de 3 cm en medio HC11. Las células deben estar bien esparcidas, pero se debe evitar el secado.<ol>
<li...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

Las células HC11 son ideales para el estudio de la diferenciación en combinación con la transformación neoplásica. Una ventaja añadida es que las células HC11 son fácilmente infectables con vectores retrovirales basados en Mo-MLV para expresar una variedad de genes. En nuestras manos, las células EpH4 eran más difíciles de infectar con los mismos vectores retrovirales que HC112.
El contacto entre células y el detención del crecimiento son requisitos previos...

En los tejidos normales o tumores, las células tienen amplias oportunidades de adhesión a sus vecinos en una organización tridimensional, y esto es imitado en el cultivo por el crecimiento celular de alta densidad. La adhesión de célula a célula se media principalmente a través de receptores de cadherina, que definen la arquitectura celular y tisular. Curiosamente, recientemente se demostró que las cadherinas también desempeñan un papel poderoso en la transducción de señales, especialmente en la señalización de supervivencia1. Paradójicamente, algunas de estas señales de adhesión de célula a célula que emanan de las cadreínas se encontraron recientemente compartidas tanto por diferenciación como por neoplasia2. Aquí, describimos métodos de inducción y evaluación de la diferenciación en dos tipos representativos de líneas celulares epiteliales de mama de ratón, HC11 y EpH4.
La línea celular epitelial de la mama de ratón HC11 puede proporcionar un modelo útil para el estudio de la diferenciación de células epiteliales. Las células HC11 son una línea celular derivada de COMMA-1D, que se origina en la glándula mamaria de un ratón Balb/c de embarazo medio3. A diferencia de otros clones derivados de COMMA-1D, el clon HC11 no tiene ningún requisito para añadir exógenamente matriz extracelular o cocultivo con otros tipos de células para la inducción in vitro del gen endógeno de caseína por hormonas lactogénicas3. Esta línea celular se ha utilizado ampliamente en estudios de diferenciación porque ha conservado características importantes del epitelio mamario normal: las células HC11 pueden reconstituir parcialmente el epitelio ductal en una almohadilla de grasa mamaria clara4. Por otra parte, se pueden diferenciar en un cultivo bidimensional (2D) cuando se cultivan a la confluencia unida a una superficie de plástico de plato de Petri en presencia de un esteroide como Hydrocortisona o Dexametasona, además de Insulina y Prolactina (medio HIP) carente de factor de crecimiento epidérmico (EGF), un inhibidor de la diferenciación5,6,7. En estas condiciones, las células HC11 producen proteínas lácteas como la caseína y la WAP, que son detectables por la hincha occidental dentro de los 4 días siguientes a la inducción. Al mismo tiempo, una porción de células HC11 forma estructuras rudimentarias mamarias similares a las glándulas denominadas "domes" de una manera estocástica. Las cúpulas son visibles de 4 a 5 días después de la inducción y aumentan gradualmente de tamaño hasta el día 10, concomitantes con un aumento en la producción de caseína8. Curiosamente, las células HC11 poseen mutante p539, y por lo tanto representan un estado preneoplásico. Por esta razón, el modelo HC11 es ideal para estudiar redes de señalización de diferenciación en conjunto con neoplasia en el mismo sistema celular.
Las células EpH4, un derivado de las células IM-2, son una línea celular no tumorigénica originalmente derivada de células epeliales de la glándula mamaria de ratón inmortalizadas espontáneamente aisladas de un ratón Balb/c de embarazo medio10. Las células EpH4 forman monocapas epeliales continuas en el cultivo 2D, pero no se diferencian en estructuras glandulares10,11. Sin embargo, después del crecimiento 3D en un material que consiste en una mezcla de proteínas de matriz extracelular producidas por las células de sarcoma de ratón EHS12 (matriz EHS, matriz o Matrigel, ver Tabla de materiales),además de la estimulación con HIP, las células EpH4 pueden recapitular las etapas iniciales de diferenciación de la glándula mamaria. En estas condiciones, las células EpH4 forman esferoides (también llamados mamesferas) que exhiben polaridad apical-basal y un lumen hueco, y son capaces de producir las proteínas lácteas-caseína y WAP, similares a las células epiteliales mamarias lactantes lactantes lactantes lactantes. Contrariamente a las células HC11, que son indiferenciadas, y algunas expresan marcadores mesenquimales13, las células EpH4 exhiben una morfología puramente luminal14. Las células EpH4 también se han divulgado para producir proteínas de la leche en el cultivo 2D a través de la estimulación con dexametasona, insulina, y prolactina15. Sin embargo, este enfoque impide el estudio de los efectos reglamentarios que imitan el microambiente de la glándula mamaria en el cultivo 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Las cadherinas desempeñan un papel importante en la regulación de la diferenciación celular, así como la neoplasia. Aquí describimos los orígenes y métodos de la inducción de la diferenciación de dos líneas celulares epiteliales de mama de ratón, HC11 y EpH4, y su uso para estudiar etapas complementarias del desarrollo de la glándula mamaria y la transformación neoplásica.
La línea celular epitelial de la mama del ratón HC11 se originó a partir de la glándula mamaria de un ratón Balb/c embarazada. Se diferencia cuando se cultiva para confluencia unida a una superficie de plástico de la placa Petri en medio que contiene suero de ternero fetal y Hydrocortisona, Insulin y Prolactin (medio HIP). En estas condiciones, las células HC11 producen las proteínas lácteas-caseína y proteína ácida de suero de leche (WAP), similares a las células epiteliales mamarias lactantes lactantes, y forman estructuras rudimentarias similares a las glándulas mamarias llamadas "domes".
La línea celular EpH4 se deriva de células epeliales de la glándula mamaria de ratón inmortalizadas espontáneamente aisladas de un ratón Balb/c embarazada. A diferencia de HC11, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en esferoides (también llamadas mamesferas) cuando se cultivan en condiciones de crecimiento tridimensionales (3D) en medio HIP. Las células son trippsinizadas, suspendidas en una matriz del 20% que consiste en una mezcla de proteínas de matriz extracelular producidas por las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), chapadas encima de una capa de matriz concentrada que recubre una placa de plástico Petri o placa multipocilíndor, y se cubren con una capa de 10% de medio HIP que contiene matriz. En estas condiciones, las células EpH4 forman esferoides huecos que exhiben polaridad apical-basal, un lumen hueco, y producen la caseína y el WAP.
Utilizando estas técnicas, nuestros resultados demostraron que la intensidad de la señal de la cadherina/Rac es fundamental para la diferenciación de las células HC11. Mientras que Rac1 es necesario para la diferenciación y bajos niveles de RacV12 activado aumentar la diferenciación, altos niveles de RacV12 bloquean la diferenciación mientras que induce neoplasia. Por el contrario, las células EpH4 representan una etapa anterior en la diferenciación epitelial mamaria, que se inhibe incluso por niveles bajos de RacV12.

Durante mucho tiempo se ha sabido que la diferenciación de células epiteliales y adipocitos requiere confluencia y compromiso de las cadherinas2. Nosotros y otros demostramos que la adhesión de célula a célula y el compromiso de E- o N-cadherin y cadherin-11, como ocurre con la confluencia de células cultivadas, desencadena un aumento dramático en la actividad de las pequeñas GTPases Rac y la proteína de control de división celular 42 (Cdc42), y este proceso conduce a la activación de l...

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Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Describimos técnicas para la inducción de diferenciación de dos líneas epiteliales mamarias, HC11 y EpH4. Mientras que ambos requieren suero de ternero fetal, insulina y prolactina para producir proteínas de la leche, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en mamesferas en cultivo tridimensional. Estos modelos complementarios son útiles para estudios de transducción de señales de diferenciación y neoplasia.

Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Las células HC11 y EpH4 son líneas celulares epiteliales mamarias de ratón que pueden diferenciarse en el cultivo. Al mismo tiempo, estas células pueden ser transformadas por un número de oncogenes. Estas células son ideales para el estudio de la interrelación entre la diferenciación y la transformación neoplásica.Estas técnicas se pueden utilizar en estudios de transducción de señales para descubrir objetivos para la terapia contra el cáncer. Por ejemplo, la pequeña GTPase Rac y otras moléculas pueden desencadenar la transformación de las células epiteliales mamarias cuando se expresan a niveles altos, pero sorprendentemente a niveles bajos, pueden inducir la diferenciación. Otros transductores de señal pueden comportarse de manera similar.Los principios pueden aplicarse a otros tipos de diferenciación, así cuando la confluencia celular juega un papel importante, por ejemplo la diferenciación de adipocitos o miotubos. Alguien que realiza esta técnica por primera vez debe tener en cuenta que el revestimiento de las células HC11 es importante. Esto se debe a que el contacto de celda a célula es importante para la diferenciación.Otro punto a tener en cuenta es que la extracción adecuada de células EpH4 de la matriz es crítica para la cuantificación de proteínas porque cualquier residuo afectará la determinación de proteínas. La demostración visual de este método es útil porque algunos detalles del protocolo son difíciles de describir en papel. Comience preparando una botella de 50 mililitros de medio celular HC11 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Para placar las células, aspirar el medio de cinco platos de Petri de seis centímetros 50% confluentes y lavar las células con aproximadamente 1,8 mililitros de tripina utilizando una pipeta Pasteur estéril de algodón de nueve pulgadas enchufada. Luego agregue 200 microlitros de trippsina por placa y gire la placa para desalojar las células conectadas. Observe la microscopía de contraste de las células bajo fase con un objetivo 4X para asegurarse de que han comenzado a desalojarse.Luego aspirar aproximadamente 1,5 mililitros de hc11 medio con una pipeta Pasteur estéril de nueve pulgadas y chorro verticalmente contra las células mientras gira el plato asegurándose de evitar salpicaduras. Transfiera todas las células al frasco con HC11 medio y arremolina para dispersarse uniformemente en el frasco. Luego aliquot la suspensión celular en 20 tres centímetros Petri platos por pipetear dos mililitros de células por plato.Mece los platos de Petri para esparcir las células e incubarlas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, cuando las células sean de 90 a 100% confluentes, aspire el medio y reemplácelo por medio con FBS pero sin EGF. Después de cultivar las células en medio sin EGF durante 24 horas, añadir el medio de diferenciación a 10 platos y cultivar las células durante un máximo de 10 días manteniendo los otros 10 platos como controles.Cambie el medio cada dos o tres días con las células tratadas con HIP y de control. Para monitorear la diferenciación, observe las células con microscopía de contraste de fase. Utilice microscopía de fluorescencia si las células expresan proteína fluorescente verde.Además, cuantificar el grado de diferenciación mediante la extracción de proteínas de las células tratadas y de control de HIP una vez al día y la realización de análisis de Western Blot. Reúna y coloque el medio de crecimiento EpH4, la matriz EHS y dos tubos cónicos de 50 mililitros sobre hielo. Precaer las placas de cultivo de tejido con puntas de pipeta a menos 20 grados Celsius y preparar el medio de crecimiento EpH4 complementado con matriz de 10 o 20% en dos tubos cónicos de 50 mililitros y mantenerlos en hielo hasta que estén listos para usar.Después de recuperar las placas de cultivo de tejido prechilled a menos 20 grados Celsius, cubra 10 pozos de la placa de 24 pozos con 150 microlitros de matriz sin diluir esparciendo la matriz con una pipeta. Evite crear burbujas al esparcir la matriz. A continuación, toque suavemente los lados de la placa e incubar la placa a 37 grados Celsius durante una hora para permitir que la matriz se solidifique.Mientras tanto, prepárese para la diferenciación mediante la trippsina de las células EpH4, así como se describió previamente y asegurando suspensiones de una sola célula después de la resuspensión de las células trippsinas. A continuación, cuente las células en suspensión con un hemocicómetro. Transfiera cinco veces 10 a las cuatro células por pozo a un tubo de centrífuga cónica estéril de 1,5 mililitros y gíselas a 250 veces g durante cinco minutos.Aspirar cuidadosamente el medio sobrenadante y colocar el tubo sobre hielo. Utilice una punta de pipeta de un mililitro para resuspender las células en 350 microlitros del medio de crecimiento EpH4 complementados con matriz de 20%mientras mantiene los tubos en hielo asegurándose de evitar burbujas. Una vez que la capa inferior se haya solidificado, agregue los 350 microlitros de suspensión celular a cada pozo recubierto y colóquelo en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una hora para permitir que la capa de matriz del 20% se solidifique.Observe las células con microscopía de contraste de fase para asegurarse de que las células individuales son visibles. A continuación, añadir 200 microlitros de EpH4 medio con matriz de 10% en la parte superior e incubar la placa a 37 grados Centígrados. Comience la inducción de diferenciación un día después de encoar las células en la matriz.Retire cuidadosamente 150 microlitros de 10% medio de matriz superior y agregue 200 microlitros de medio EpH4 que contengan HIP y matriz del 10% y para los controles agregue un medio de matriz del 10% sin HIP. Sustituya el medio cada dos días durante un máximo de 10 días de monitorización de la formación de la mamosfera por microscopía de contraste de fase. Para cuantificar la diferenciación, pipetee cuidadosamente el medio HIP de 10%matriz de los pozos y enjuague la capa de matriz del 20% con 350 microlitros de PBS frío.A continuación, agregue de 70 a 100 microlitros de PBS helado con un EDTA mililolar directamente en los pozos y desenganche suavemente la capa inferior de 100% matriz con una punta de pipeta. Agitar suavemente el plato a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Transfiera cuidadosamente la suspensión del esferoide a un tubo cónico y enjuague los pozos con 500 microlitros de PBS EDTA para recuperar los esferoides restantes.Mece el tubo sobre hielo durante 30 minutos adicionales asegurándose de que la matriz se disuelva por completo. Si se ven grumos de matriz visible, agregue más PBS EDTA o agite más tiempo. Centrifugar la solución a 350 veces g para peletizar los esferoides.A continuación, aspirar el sobrenadante,lyse los esferoides, y sondear las células para beta-caseína, ciclina D1, y p120RasGAP por hinchazón occidental. Hay una sorprendente dependencia de la diferenciación sobre la fuerza de la señal Rac en las células HC11. Mientras que el CRAC1 endógeno es necesario para la diferenciación y los bajos niveles de RacV12 activado mutacionalmente causan un aumento en la capacidad de diferenciación, los altos niveles de RacV12 desencadenan un bloque de diferenciación e inducen neoplasia.Cuando se exploraron las propiedades de diferenciación de las células EpH4 en un cultivo de matriz 3D, se encontró que la producción de beta-caseína alcanzó un máximo de ocho a 10 días y la expresión de la ciclina D1 fue máxima a los cuatro a seis días después de la estimulación hip. Para determinar el posicionamiento de las células individuales, se teñiron con DAPI y se tomaron imágenes con microscopía confocal. La muerte celular interna y la formación de lúmenes huecos se observaron en las mamosferas, mientras que la adición de HGF dio lugar a la formación de estructuras tubulares.Alguien que realiza esta técnica por primera vez debe tener en cuenta que el revestimiento de las células HC11 es importante. También la extracción adecuada de las células EpH4 de la matriz es fundamental para la cuantificación de proteínas porque cualquier residuo afectará la determinación de proteínas. Esta técnica se puede utilizar para investigar otros transductores de señal que pueden comportarse de manera similar.Si hay mutaciones del conductor en un cáncer, entonces su inhibición completa no será necesaria ya que los niveles bajos restantes realmente inducirían la diferenciación.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Síntesis y caracterización de un profármaco Aspirina-fumarato que inhibe la actividad de NFkB y de la mama células madre del cáncer

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluación de la capacidad de diferenciación de las células epiteliales de próstata de ratón utilizando el cultivo organoide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...