Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

HC11 cel linje var vänligt tillhandahålls av Dr D. Medina (Houston, TX). Författarna är tacksamma mot Dr Andrew Craig av Queen's University för många reagenser och värdefulla förslag. EpH4 celler var en gåva från Dr C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick gav utmärkt tekniskt stöd för 3D-kulturstudier.
Det ekonomiska stödet från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), canadian Breast Cancer Research Alliance , Ontario Centres of Excellence, Breast Cancer Action Kingston (BCAK) och Clare Nelson testamente fond genom bidrag till LR är tacksamt erkänt. BE fått bidragfrån CIHR, CBCF, BCAK och Cancer Research Society Inc. PTG stöds av en Kanada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC och Canadian Cancer Society. MN stöddes av ett studentskap från Terry Fox Training Program i tvärvetenskaplig cancerforskning från NCIC, en Graduate award (QGA), och en Dean's Award från Queen's University. MG stöddes av postdoktorala stipendier från US Army Breast Cancer Program, ministeriet för forskning och innovation i provinsen Ontario och advisory research committee of Queen's University. VH stöddes av en CBCF-doktorsgemenskap och ett postdoktoral stipendium från Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research i samarbete med CIHR. Hanad Adan var mottagare av en NSERC sommar studentship. BS stöddes av en Queen's University graduate award.

1. Plätering HC11 Celler
<ol><li>I en laminär flödeshuva med sterila tekniker förbereda en flaska med 50 ml HC11 cellmedium: RPMI-1640 med 10% fetalt bovinserum (FBS), 5 μg/mL insulin och 10 ng/ml EGF (se Materialtabell).</li>
	<li>Platta cirka 400.000 celler per 3 cm Petri maträtt: Passera två 10 cm, 50% confluent Petri rätter i tjugo 3 cm rätter i HC11 medium. Cellerna måste vara väl utspridda men torkning måste undvikas.<ol>
<li>Sug upp mediet i en kolv med hjälp av en vakuumpump.</li>
...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

HC11 celler är idealiska för studier av differentiering i samband med neoplastisk omvandling. En extra fördel är att HC11 celler lätt kan infekteras med Mo-MLV-baserade retrovirala vektorer för att uttrycka en mängd olika gener. I våra händer var EpH4 celler svårare att infektera med samma retrovirala vektorer än HC112.
Cell-till-cell kontakt och tillväxt gripande är viktiga förutsättningar för HC11 cell differentiering. Således, för att uppnå enhetli...

I normala vävnader eller tumörer, celler har omfattande möjligheter för vidhäftning till sina grannar i en tredimensionell organisation, och detta härmade i kulturen av hög densitet celltillväxt. Cell-till-cell vidhäftning förmedlas främst genom kaherinreceptorer, som definierar cell- och vävnadsarkitektur. Intressant nog visades det nyligen att kaheriner också spelar en kraftfull roll i signaltransduktion, särskilt i överlevnad signalering1. Paradoxalt nog visade sig några av dessa cell-till-cell-vidhäftningssignaler som härrör från kaheriner nyligen delas av både differentiering och neoplasi2. Här beskriver vi metoder för induktion och bedömning av differentiering i två representativa typer av musbröstepitelcellinjer, HC11 och EpH4.
DEN HC11 mus bröst epitelial cell linjen kan ge en användbar modell för studier av epitel cell differentiering. HC11 celler är en COMMA-1D-härledd cellinje, som härrör från bröstkörteln av en mitten gravid Balb / c mus3. I motsats till andra COMMA-1D derivat kloner, HC11 klon har inget krav på exogent tillagd extracellulär matris eller samodling med andra celltyper för in vitro induktion av endogenβ-kasein genen av laktogena hormoner3. Denna cellinje har använts i stor utsträckning i differentieringstudier eftersom den har behållit viktiga egenskaper hos den normala bröstepitel: HC11 celler kan delvis rekonstruera duktepitel i en rensad bröst fett pad4. Dessutom kan de skilja i en tvådimensionell (2D) kultur när odlas till sammanflödet fäst vid en plast Petri maträtt yta i närvaro av en steroid som Hydrocortisone eller Dexametason, förutom Insulin och Prolactin (HIP medium) saknar epidermal tillväxtfaktor (EGF), en hämmare av differentiering5,6,7. . Under dessa förhållanden producerar HC11-celler mjölkproteiner som β-kasein och WAP, som kan detekteras av western blotting inom 4 dagar efter induktion. Samtidigt bildar en del av HC11 celler rudimentära bröstkörtelliknande strukturer som kallas "kupoler" på ett stokastiska sätt. Kupoler är synliga 4-5 dagar efter induktion och gradvis öka i storlek upp till dag 10, samtidigt med en ökning av β-kasein produktion8. Intressant nog har HC11 celler mutant p539, och representerar därför ett preneoplastic tillstånd. Av denna anledning är HC11-modellen idealisk för att studera signalnätverk av differentiering i samband med neoplasi i samma cellsystem.
EpH4 celler, ett derivat av IM-2 celler, är en nontumorigenic cellinje ursprungligen härrör från spontant förevigade mus bröstkörtel epitelceller isolerade från en mitten gravid Balb / c mus10. EpH4 celler bildar kontinuerliga epitelial monolayers i 2D-kultur, men inte skilja i körtelliknande strukturer10,11. Men efter 3D-tillväxt i ett material som består av en blandning av extracellulära matrisproteiner som produceras av EHS mus sarkomceller12 (EHS matris, matris eller Matrigel, se Table of Materials), förutom stimulering med HIP, EpH4 celler kan sammanfatta de inledande stadierna av bröstkörtel differentiering. Under dessa förhållanden bildar EpH4-celler sfäroider (även kallade mammografi) som uppvisar apical-basal polaritet och en ihålig lumen, och kan producera mjölkproteiner β-kasein och WAP, liknande lakterande däggdjur epitelceller. Tvärtemot HC11 celler, som är odifferentierade, och några uttryckliga mesenchymal markörer13, EpH4 celler uppvisar en rent luminal morfologi14. EpH4 celler har också rapporterats att producera mjölkproteiner i 2D-kultur genom stimulering med dexametason, insulin och prolaktin15. Detta tillvägagångssätt utesluter dock studier av regleringseffekter som efterliknar mikromiljön i 3D-kulturen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Cadherins spelar en viktig roll i regleringen av celldifferentiering samt neoplasi. Här beskriver vi ursprunget och metoderna för induktion av differentiering av två musbröstepitelcellinjer, HC11 och EpH4, och deras användning för att studera kompletterande stadier av mammary körtelutveckling och neoplastisk omvandling.
HC11 mus bröst epitel cell linje härstammar från bröstkörteln av en gravid Balb / c mus. Det skiljer när odlas till sammanflödet fäst vid en plast Petri maträtt yta i medium som innehåller fetala kalv serum och Hydrocortisone, Jagnsulin och Prolactin (HIP medium). Under dessa förhållanden producerar HC11-celler mjölkproteinerna β-kasein och vasslesyraprotein (WAP), liknande lakterande däggdjursepitelceller, och bildar rudimentära bröstkörtelliknande strukturer som kallas "kupoler".
EpH4-cellinjen härstammar från spontant förevigade musbröstkörtelepitelceller isolerade från en gravid Balb/c-mus. Till skillnad från HC11 kan EpH4-celler helt skilja åt i sfäroider (även kallade mammsfärer) när de odlas under tredimensionella (3D) tillväxtförhållanden i HIP medium. Celler trypsinized, upphängd i en 20% matris bestående av en blandning av extracellulära matrisproteiner som produceras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkomceller, pläterade ovanpå ett lager av koncentrerad matris beläggning en plast Petri skålen eller multiwell platta, och täckt med ett lager av 10% matris-innehållande HIP medium. Under dessa förhållanden bildar EpH4-celler ihåliga sfäroider som uppvisar apical-basal polaritet, en ihålig lumen, och producerar β-kasein och WAP.
Med hjälp av dessa tekniker visade våra resultat att intensiteten i katern/rac-signalen är avgörande för differentieringen av HC11-celler. Medan Rac1 är nödvändigt för differentiering och låga nivåer av aktiverad RacV12 öka differentiering, hög RacV12 nivåer blockera differentiering medan inducerande neoplasi. Däremot representerar EpH4-celler ett tidigare steg i däggdjurepiteldifferentiering, som hämmas av även låga nivåer av RacV12.

Det har länge varit känt att differentiering av epitelceller och adipocyter kräver sammanflödet och engagemang av kaheriner2. Vi och andra visade att cell-till-cell vidhäftningar och engagemang av E- eller N-cadherin och cadherin-11, som uppstår med sammanflödet av odlade celler, utlöser en dramatisk ökning av aktiviteten hos de små GTPases Rac och celldelningskontroll protein 42 (Cdc42), och denna process leder till aktivering av interleukin-6 (IL6) familj cytokiner och Stat3 (signal gi...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Vi beskriver tekniker för differentiering induktion av två bröst epitel linjer, HC11 och EpH4. Medan båda kräver fetala kalv serum, insulin och prolaktin för att producera mjölkproteiner, EpH4 celler kan helt skilja i mammografi i tredimensionell kultur. Dessa kompletterande modeller är användbara för signaltransduktionsstudier av differentiering och neoplasi.

Differentiering av Musbröstepitel HC11 och EpH4 Celler

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

HC11 och EpH4 celler är mus bröst epitelial cellinjer som kan skilja i kultur. Samtidigt kan dessa celler omvandlas av ett antal onkogener. Dessa celler är idealiska för studier av det inbördes förhållandet mellan differentiering och den neoplastiska omvandlingen.Dessa tekniker kan användas i signaltransduktionsstudier för att upptäcka mål för cancerbehandling. Till exempel, den lilla GTPase Rac och andra molekyler kan utlösa omvandling av bröst epitelceller när de uttrycks till höga nivåer, men överraskande på låga nivåer, de kan inducera differentiering. Andra signalgivare kan uppträda på liknande sätt.Principerna kan gälla andra typer av differentiering samt där cellkonfluens spelar en viktig roll, till exempel differentiering av adipocyter eller myotubes. Någon som utför denna teknik för första gången bör ha i åtanke att plätering av HC11 cellerna är viktigt. Detta beror på att cell-till-cell-kontakt är viktigt för differentiering.En annan punkt att se upp är att korrekt utvinning av EpH4 celler från matrisen är kritisk för protein quantitation eftersom eventuella rester kommer att påverka protein bestämning. Visuell demonstration av den här metoden är användbar eftersom vissa detaljer i protokollet är svåra att beskriva på papper. Börja med att förbereda en flaska på 50 milliliter HC11 cellmedium enligt manuskriptriktningar.För att platta cellerna, aspirera mediet från fem sex centimeter 50%konfluenta Petri-rätter och tvätta cellerna med cirka 1,8 milliliter trypsin med hjälp av en steril nio tums bomull pluggad Pasteur pipetten. Tillsätt sedan 200 mikroliter trypsin per platta och snurra plattan för att rubba de bifogade cellerna. Observera cellerna under faskontrastmikroskopi med ett 4X-mål för att se till att de har börjat lossna.Sedan aspirera cirka 1,5 milliliter HC11 medium med en steril nio tum Pasteur pipetten och spruta den vertikalt mot cellerna samtidigt roterande skålen se till att undvika stänk. Överför alla celler till flaskan med HC11 medium och virvel för att skingra jämnt i flaskan. Sedan alikvoten i 20 tre centimeter petriskålar genom pipettering av två milliliter celler per fat.Rock petriskålarna för att sprida cellerna och ruva dem i 37 grader Celsius och 5%koldioxid över natten. På nästa dag när cellerna är 90 till 100%konfluent, aspirera mediet och ersätta det med medium med FBS men utan EGF. Efter att ha odlat cellerna i medium utan EGF i 24 timmar, tillsätt differentieringsmedium till 10 rätter och odla cellerna i upp till 10 dagar hålla de andra 10 rätter som kontroller.Byt medium varannan till var tredje dag med både HIP-behandlade och kontrollceller. För att övervaka differentiering, observera cellerna med faskontrastmikroskopi. Använd fluorescensmikroskopi om cellerna uttrycker grönt fluorescerande protein.Dessutom kvantifiera graden av differentiering genom att extrahera proteiner från HIP behandlade och kontroll celler en gång per dag och utför Western Blot analys. Samla och placera EpH4 tillväxtmedium, EHS-matrisen, och två koniska 50 milliliter rör på is. Prechill vävnaden kultur plattor med pipett tips på minus 20 grader Celsius och förbereda EpH4 tillväxt medium kompletterat med 10 eller 20%matris i två 50 milliliter koniska rör och hålla dem på is tills de är färdiga att använda.Efter att ha hämtat de prechilled vävnad kulturplattorna vid minus 20 grader Celsius, päls 10 brunnar av 24-brunnsplattan med 150 mikroliter av outspädd matris genom att sprida matrisen med en pipetter. Undvik att skapa bubblor när matrisen sprids. Knacka sedan försiktigt på sidorna av plattan och inkubera plattan i 37 grader Celsius i en timme så att matrisen att stelna.Under tiden förbereda sig för differentiering genom trypsinizing de EpH4 cellerna väl som tidigare beskrivits och säkerställa enstaka cell suspensioner efter resuspension av trypsinized celler. Därefter räknar cellerna i suspension med en hemocytometer. Överför fem gånger 10 till de fyra cellerna per brunn till ett 1,5 milliliter sterilt koniskt centrifugrör och snurra dem på 250 gånger g i fem minuter.Aspirera försiktigt supernatantmediet och placera röret på is. Använd en en milliliter pipett spets för att resuspend cellerna i 350 mikroliter av EpH4 tillväxt medium kompletteras med 20%matrix samtidigt som rören på is se till att undvika bubblor. När bottenskiktet har stelnat, tillsätt 350 mikroliter av cell suspension till varje belagda väl och placera den i en koldioxid inkubator på 37 grader Celsius i en timme så att 20%matrix lagret att stelna.Observera cellerna med faskontrastmikroskopi för att se till att enstaka celler är synliga. Tillsätt sedan 200 mikroliter av EpH4-medium med 10%matrix ovanpå och inkubera plattan vid 37 grader Celsius. Påbörja differentieringsinduktion en dag efter plätering av cellerna i matrisen.Ta försiktigt bort 150 mikroliter av topp 10%matris medium och tillsätt 200 mikroliter av EpH4 medium som innehåller HIP och 10%matrix och för kontroller lägga till en 10%matris medium utan HIP. Byt ut mediet varannan dag i upp till 10 dagar med övervakning av mammosfärbildning med faskontrastmikroskopi. För att kvantifiera differentiering, försiktigt pipettera av 10%matrix HIP medium från brunnarna och skölj 20%matrisskiktet med 350 mikroliter av iskall PBS.Tillsätt sedan 70 till 100 mikroliter iskall PBS med en millimolar EDTA direkt i brunnarna och försiktigt lossa det nedre lagret av 100%matrix med en pipettspets. Skaka plattan försiktigt i fyra grader Celsius i 30 minuter. Överför försiktigt sfäroidupphängningen till ett koniskt rör och skölj brunnarna med 500 mikroliter pbs EDTA för att återvinna eventuella kvarvarande sfäroider.Vagga röret på is i ytterligare 30 minuter och se till att matrisen helt löses upp. Om synliga matrisklump ses, tillsätt mer PBS EDTA eller skaka längre. Centrifugera lösningen vid 350 gånger g för att pelleta sfäroiderna.Sedan aspirera supernatanten, lyse sfäroiderna, och sond cellerna för beta-casein, cyclin D1, och p120RasGAP av västra blotting. Det finns ett slående beroende av differentiering på styrkan av Rac signalen i HC11 celler. Medan endogen CRAC1 krävs för differentiering och låga nivåer av mutationally aktiverat RacV12 orsaka en ökning av differentiering kapacitet, hög RacV12 nivåer utlösa ett block av differentiering och inducera neoplasi.När differentieringsegenskaperna för EpH4 celler utforskades i en 3D-matris kultur, konstaterades det att beta-casein produktion nådde åtta till 10 dagar och cyclin D1 uttryck var maximal på fyra till sex dagar efter HIP stimulering. För att bestämma placeringen av enskilda celler, var de färgas med DAPI och avbildas med confocal mikroskopi. Inre cell död och bildandet av ihåliga lumen observerades i mammospheres medan tillsats av HGF resulterade i bildandet av tubular strukturer.Någon som utför denna teknik för första gången bör ha i åtanke att plätering av HC11 cellerna är viktigt. Också korrekt extraktion av EpH4 cellerna från matrisen är kritisk för protein quantitation eftersom eventuella rester kommer att påverka protein bestämning. Denna teknik kan användas för att undersöka andra signalgivare som kan bete sig på ett liknande sätt.Om det finns förare mutationer i en cancer, då deras fullständiga hämning kommer inte att vara nödvändigt eftersom låga nivåer kvar faktiskt skulle inducera differentiering.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Syntes och karakterisering av en Aspirin-fumarat Prodrug som hämmar NFkB aktivitet och bröstcancerstamceller

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Beteende av humana bröstcancerceller i embryonal zebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-imaging av bröstcancer epitelial cellmigration efter övergående utarmning av TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Ortotop injektion av bröstcancerceller i möss mjölkkörtlar fettet Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modellering bröst cancer via en intraductal injektion av CRE-uttrycker adenovirus i musen bröstkörteln

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Utvärdering av differentierings kapacitet av mus prostata epitelceller med Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Ortopisk transplantation av brösttumörer som prekliniska modeller för bröstcancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Utvärdering av Oncogenic Transformation i mänskliga mammary Epitelial celler

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering och funktionell bedömning av mänskliga bröstcancerstamceller från cell- och vävnadsprover

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Studerar TGF-β signal- och TGF-β-inducerad epitelial-till-mesenkymal övergång i bröstcancer och normala celler

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...