Name: differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

HC11 hücre hattı dr. D. Medina (Houston, TX) tarafından sağlanmıştır. Yazarlar Dr Andrew Craig Queen's Üniversitesi birçok reaktifler ve değerli öneriler için müteşekkiriz. EpH4 hücreleri Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver) tarafından hediye edildi. Colleen Schick 3D kültür çalışmaları için mükemmel teknik yardım sağladı.
Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR), Kanada Meme Kanseri Vakfı (CBCF, Ontario Bölüm), Kanada Meme Kanseri Araştırma İttifakı mali yardım , Ontario Mükemmellik Merkezleri, Meme Kanseri Eylem Kingston (BCAK) ve LR hibe yoluyla Clare Nelson miras fonu minnetle kabul edilmektedir. BE CIHR, CBCF, BCAK ve Kanser Araştırma Derneği A.Ş. PTG bir Kanada Araştırma Başkanı, Kanada Yenilik Vakfı, CIHR, NSERC ve Kanada Kanser Derneği tarafından desteklenir hibe desteği aldı. MN NCIC'den Disiplinlerarası Kanser Araştırmaları Terry Fox Eğitim Programı'ndan bir öğrencilik, Bir Lisansüstü ödülü (QGA) ve Queen's University'den Dekan Ödülü ile desteklenmiştir. MG, ABD Ordusu Meme Kanseri Programı, Ontario Eyaleti Araştırma ve Yenilik Bakanlığı ve Queen's University Danışma Araştırma Komitesi'nden doktora sonrası burslar tarafından desteklendi. VH, CIHR ile işbirliği içinde Terry Fox Vakfı Eğitim Programı'ndan Bir CBCF doktora bursu ve doktora sonrası burs ile desteklenmiştir. Hanad Adan Bir NSERC yaz öğrencilik alıcı oldu. BS, Queen's University lisansüstü ödülü ile desteklendi.

1. KAPLAMA HC11 Hücreleri
<ol><li>Steril teknikler kullanarak bir laminar akış kaputunda 50 mL HC11 hücreli ortama sahip bir şişe hazırlayın: RPMI-1640 %10 fetal sığır serumu (FBS), 5 g/mL insülin ve 10 ng/mL EGF (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>3 cm Petri kabı başına yaklaşık 400.000 hücre: İki 10 cm, %50 confluent Petri tabaklarını HC11 orta sında yirmi 3 cm'lik tabaklara geçirin. Hücreler iyi dağılmış olmalı ama kurutma kaçınılmalıdır.<ol>
<li>Bir vakum pompası ku...

<ol>
	<li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaged+for+survival;+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation.">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin/Rac+axis.">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li><li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line.">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li><li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function.">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth &amp; differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells:+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors.">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li><li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation.">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).</li><li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation.">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).</li><li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation.">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).</li><li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53.">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li><li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally.">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li><li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation.">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li><li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells.">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li><li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression.">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).</li><li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties.">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li><li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands.">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).</li><li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li><li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130/Stat3+axis.">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li><li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R(h)oads+to+Stat3:+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases.">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+structure,+to+survival:+Stat3+activation+by+cadherin+engagement.">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li><li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3.">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li><li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).</li><li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1/2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner.">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth &amp; Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+gene+products;+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells.">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li><li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).</li><li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+(Stat3)+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+(NHE3)+expression.">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li><li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications.">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li><li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).</li></ol>

HC11 hücreleri neoplastik transformasyon ile birlikte farklılaşma çalışmaları için idealdir. Ek bir avantajı HC11 hücreleri kolayca Mo-MLV tabanlı retroviral vektörler ile genlerin çeşitli ifade etmek için enfekte olmasıdır. Elimizde, EpH4 hücreleri HC112daha aynı retroviral vektörleri ile enfekte daha zordu.
Hücreden hücreye temas ve büyüme durması HC11 hücre farklılaşmasıiçin önemli ön koşullardır. Bu nedenle, hücre tabakası arasın...

Normal dokularda veya tümörlerde, hücreler üç boyutlu bir organizasyonda komşularına yapışma için geniş fırsatlara sahiptir ve bu da kültürde yüksek yoğunluklu hücre büyümesi ile taklit edilir. Hücre-hücre adezyonu esas olarak hücre ve doku mimarisini tanımlayan kadherin reseptörleri aracılığıyla aracılık edilir. İlginçtir, son zamanlarda kadherinler de sinyal iletimi güçlü bir rol oynadığı gösterilmiştir, özellikle hayatta kalma sinyalizasyon1. Paradoksal olarak, kadherinlerden yayılan bu hücreden hücreye yapışma sinyallerinin bir kısmının yakın zamanda hem farklılaşma hem de neoplazi2ile paylaşıldığı bulunmuştur. Burada fare meme epitel hücre hatları, HC11 ve EpH4 iki temsili tip tedisiyasyon indüksiyon ve değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır.
HC11 fare meme epitel hücre hattı epitel hücre farklılaşması çalışma için yararlı bir model sağlayabilir. HC11 hücreleri, orta gebe balb/c fare3'ünmeme bezinden kaynaklanan, VIRGÜL-1D türetilmiş bir hücre hattıdır. Diğer VIRMAN-1D türevi klonların aksine, HC11 klonu ekselolarak ekselansları ekstrasellüler matriks veya laktojenik hormonlar tarafından endojen β-kazein geninin in vitro indüksiyonu için diğer hücre tipleri ile birlikte eklenme gereksinimi yoktur3. Bu hücre hattı, normal meme epitelinin önemli özelliklerini koruduğu için ayırım çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır: HC11 hücreleri kısmen temizlenmiş bir meme yağ yastığında duktal epiteli yeniden oluşturabilir4. Ayrıca, h ydrokortizon veya Deksametazon gibi bir steroid varlığında plastik petri çanak yüzeyine bağlı biraraya yetiştirilen bir iki boyutlu (2D) kültür ayırt edebilirsiniz, Insulin ve Prolactin ek olarak (HIP orta) epidermal büyüme faktörü yoksun (EGF), farklılaşma bir inhibitörü5,6,7. Bu koşullar altında, HC11 hücreleri β-kazin ve WAP gibi süt proteinleri üretirler ve indüksiyondan sonraki 4 gün içinde Batı lekeleme ile saptanabilir. Aynı zamanda, HC11 hücrelerinin bir kısmı stochastic bir şekilde "kubbeler" olarak adlandırdığı temel meme bezi benzeri yapılar oluşturur. Kubbeler indüksiyondan 4-5 gün sonra görülebilir ve 10. İlginçtir, HC11 hücreleri mutant p539sahip , ve bu nedenle bir preneoplastik devlet temsil eder. Bu nedenle, HC11 modeli ideal aynı hücre sisteminde neoplazi ile birlikte farklılaşma sinyal ağları çalışmak için uygundur.
EPH4 hücreleri, IM-2 hücrelerinin bir türevi, bir nontumorigenic hücre hattı aslında bir orta hamile Balb / c fare izole spontan ölümsüzleştirilmiş fare meme bezi epitel hücreleri türetilmiştir10. EpH4 hücreleri 2D kültürde sürekli epitel monolayers formu, ancak glandüler benzeri yapılar10,11ayırt yok. Ancak, EHS fare sarkomu hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler matriks proteinlerinin bir karışımından oluşan bir malzemede 3D büyüme sonrasında12 (EHS matris, matris veya Matrigel, Bkz. Malzeme Tablosu),HIP ile uyarılmaya ek olarak, EpH4 hücreleri meme bezi farklılaşmasının ilk aşamalarını özetleyebilir. Bu koşullar altında, EpH4 hücreleri apical-bazal polarite ve içi boş bir lümen sergileyen küresel (mammospheres olarak da adlandırılır) oluştururlar ve süt proteinleri β-kazin ve WAP üretme yeteneğine sahiptirler, emziren meme epitel hücrelerine benzer. Farklılaşmamış HC11 hücrelerinin aksine, ve bazı ekspres mezenkimal belirteçler13, EpH4 hücreleri tamamen luminal morfolojisi sergiler14. EpH4 hücrelerinin de deksametazon, insülin ve prolaktin15ile stimülasyon yoluyla 2D kültürde süt proteinleri üretmek için bildirilmiştir. Ancak bu yaklaşım, 3D kültürde meme bezi mikroçevresini taklit eden düzenleyici etkilerin araştırılmasını engellemektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1610154</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cyclin D1 antibody</td>
			<td>rabbit, Santa Cruz</td>
			<td>sc-717</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 antibody</td>
			<td>mouse, Santa Cruz</td>
			<td>sc-373751</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; actin antibody</td>
			<td>mouse, Cell Signalling technology</td>
			<td>3700</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946; casein antibody</td>
			<td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17971</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>APR600</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9643-1L-KC</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>ALB007.500</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-5061</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2284-25ML</td>
			<td>Protein Determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>14952-500</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>EDT001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Medium for HC11 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-751</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-2004</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Anti-Mouse HRP</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow hood</td>
			<td>BioGard Hood</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>LEU001.10</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CACB 354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Goat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8360</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 Reagent</td>
			<td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td>
			<td>475904-100GM</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOV850</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P207</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>125F-0262</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7681-49-4</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon digital Camera</td>
			<td>Coolpix 995</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1620112</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9016-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Olympus IX70</td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td>Lysis Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMX GFP Rac G12V</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolactin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6520</td>
			<td>HIP Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>Cell Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate-24 well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1836.300</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Apparatus</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>EBU-302</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Acetate</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TRA222.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-07-7.</td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bio Shop</td>
			<td>TWN510.500</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veritical Gel Electrophoresis System</td>
			<td>CBS Scientific Co</td>
			<td>MGV-202-33</td>
			<td>Western Blotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse breast epithelial hc11 and eph4 cells

Kadherinler hücre farklılaşmasının düzenlenmesinde ve neoplazide önemli rol oynarlar. Burada iki fare meme epitel hücre hatları, HC11 ve EpH4 farklılaşma indüksiyon uyupasyon ve meme bezi gelişimi ve neoplastik dönüşüm tamamlayıcı aşamaları çalışma da bunların kullanımı açıklar.
HC11 fare meme epitel hücre hattı hamile bir Balb / c fare meme bezi kökenli. Fetal baldır serumu ve Hydrokortizon, Insulin ve Prolactin (HIP medium) içeren orta derecede plastik Petri kabı yüzeyine bağlı olarak biraraya geldiğinde farklılaşır. Bu koşullar altında, HC11 hücreleri süt proteinleri β-kazein ve peynir altı suyu asidik protein (WAP), emziren meme epitel hücrelerine benzer üretmek ve "kubbe" olarak adlandırılır ilkel meme bezi benzeri yapılar oluştururlar.
EpH4 hücre hattı, hamile bir Balb/c fareden izole edilmiş kendiliğinden ölümsüzleştirilmiş fare meme bezi epitel hücrelerinden türetilmiştir. HC11'in aksine, EpH4 hücreleri HIP ortamda üç boyutlu (3D) büyüme koşulları altında kültürlendiğinde küresel (mammospheres olarak da adlandırılır) tam olarak ayırt edilebilirler. Hücreler, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkom hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler matriks proteinlerinin karışımından oluşan %20'lik bir matris içinde, plastik petri kabını veya çok kuyulu plakayı kaplayan konsantre matris tabakasının üzerine kaplanmış ve %10 matris içeren HIP ortamı tabakası ile kaplanır. Bu koşullar altında, EpH4 hücreleri apical-bazal polarite, içi boş bir lümen sergileyen ve β-kazein ve WAP üreten içi boş küreseller oluştururlar.
Bu teknikleri kullanarak, sonuçlarımız cadherin/Rac sinyalinin yoğunluğunun HC11 hücrelerinin farklılaşması için kritik öneme sahip olduğunu göstermiştir. Rac1 farklılaşma ve aktive RacV12 artış farklılaşma düşük seviyelerde için gerekli iken, yüksek RacV12 düzeyleri neoplazi indüklerken farklılaşmayı engeller. Buna karşılık, EpH4 hücreleri meme epitelyal diferansiyasyon daha önceki bir aşamayı temsil, Hangi RacV12bile düşük seviyelerde inhibe edilir .

Uzun epitel hücreleri ve adipositlerin farklılaşması biraraya ve kadherinler2nişan gerektirir bilinmektedir . Biz ve diğerleri, E- veya N-kadherin ve kadherin-11 hücre-hücre adezyon ve nişan gösterdi kültürlü hücrelerin birleşimi ile oluşur, küçük GTPases Rac ve hücre bölünmesi kontrol protein 42 (Cdc42) aktivitesinde dramatik bir artış tetikler ve bu süreç interlökin aktivasyonu yol açar-6 (IL6) aile sitokinler ve Stat3 (sinyal transdüser ve transkripsiyon aktivatör-...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells at JoVE.com

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Biz iki meme epitel hatları, HC11 ve EpH4 farklılaşma indüksiyon teknikleri açıklayın. Her ikisi de süt proteinleri üretmek için fetal buzağı serumu, insülin ve prolaktin gerektirirken, EpH4 hücreleri üç boyutlu kültürde mammospheres içine tam olarak ayırt edebilirsiniz. Bu tamamlayıcı modeller farklılaşma ve neoplazi sinyal iletimi çalışmaları için yararlıdır.

Fare Meme Epitel HC11 ve EpH4 Hücrelerinin Farklılaşması

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

HC11 ve EpH4 hücreleri, kültürde ayırt edilebilen fare meme epitel hücre çizgileridir. Aynı zamanda, bu hücreler onkogenler bir dizi tarafından dönüştürülebilir. Bu hücreler farklılaşma ve neoplastik dönüşüm arasındaki ilişki çalışması için idealdir.Bu teknikler sinyal iletim çalışmalarında kanser tedavisi için hedefleri keşfetmek için kullanılabilir. Örneğin, küçük GTPase Rac ve diğer moleküller yüksek seviyelere ifade edildiğinde meme epitel hücrelerinin dönüşümünü tetikleyebilir, ama şaşırtıcı düşük seviyelerde, onlar farklılaşma neden olabilir. Diğer sinyal dönüştürücüleri de benzer şekilde davranabilir.Bu ilkeler, hücre birleşiminin önemli bir rol oynadığı diğer farklılaşma türlerine de uygulanabilir, örneğin adipositlerin veya miyotüplerin farklılaşması gibi. Bu tekniği ilk kez yapan biri, HC11 hücrelerinin kaplamasının önemli olduğunu unutmamalıdır. Bunun nedeni hücreden hücreye temas farklılaşma için önemlidir olmasıdır.Dikkat edilmesi gereken bir diğer nokta da, eph4 hücrelerinin matristen doğru şekilde çıkarılmasının protein niceliği için kritik öneme sahip olmasıdır, çünkü herhangi bir kalıntı protein tayinini etkileyecektir. Protokolün bazı ayrıntılarını kağıt üzerinde açıklamak zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır. El yazması talimatlara göre 50 mililitre HC11 hücreli ortam bir şişe hazırlayarak başlayın.Hücreleri kaplamak için, beş altı santimetre 50% confluent Petri yemekleri orta aspire ve steril dokuz inç pamuk bağlı Pasteur pipet kullanarak trypsin yaklaşık 1.8 mililitre ile hücreleri yıkayın. Sonra plaka başına trypsin 200 mikrolitre ekleyin ve bağlı hücreleri yerinden etmek için plaka girdap. Faz kontrast mikroskopisi altındaki hücreleri 4X hedefiyle gözlemleyin ve yerinden çıkmaya başladıklarından emin olun.Daha sonra steril bir dokuz inç Pasteur pipet ile HC11 orta yaklaşık 1,5 mililitre aspire ve sıçramasını önlemek için emin yapmak çanak döndürerek hücrelere karşı dikey olarak fışkırtMak. HC11 orta ve girdap ile şişe ye tüm hücreleri aktarın şişe eşit dağıtmak için. Sonra 20 üç santimetre Petri yemekleri içine hücre süspansiyon aliquot her çan başına iki mililitre hücre pipetting tarafından.Hücreleri yaymak ve bir gecede 37 santigrat derece ve % 5 karbondioksit onları kuluçka yayılımı için Petri yemekleri Rock. Ertesi gün hücreler %90-100 konfluent olduğunda, ortamı aspire edin ve egf olmadan orta ile değiştirin. 24 saat EGF olmadan orta hücreleri büyüttükten sonra, 10 yemekler için farklılaşma orta ekleyin ve kontrol olarak diğer 10 yemekleri tutarak 10 güne kadar hücreleri büyümek.Hem KALÇA tedavi ve kontrol hücreleri ile her iki ila üç günde bir orta değiştirin. Farklılaşmayı izlemek için faz kontrastlı mikroskopile hücreleri gözlemleyin. Hücreler yeşil floresan protein ifade ediyorsanız floresan mikroskobu kullanın.Ayrıca, kalça tedavi ve kontrol hücreleri günde bir kez proteinleri ayıklayarak ve Batı Blot analizi gerçekleştirerek farklılaşma derecesini ölçmek. EpH4 büyüme ortamını, EHS matrisini ve buz üzerinde iki konik 50 mililitrelik tüpü toplayın ve yerleştirin. Eksi 20 santigrat derece pipet uçları ile doku kültür plakaları prechill ve iki 50 mililitrekonik tüpler 10 veya% 20 matris ile takviye EpH4 büyüme ortamı hazırlamak ve kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutmak.Eksi 20 santigrat derece önceden soğutulmuş doku kültür plakaları aldıktan sonra, bir pipet ile matris yayArak seyreltilmemiş matris 150 mikrolitre ile 24-iyi plaka 10 kuyu kat. Matris ilerlerken kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Daha sonra yavaşça plakanın kenarlarına dokunun ve matrisin katılaşabilmesi için plakayı 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Bu arada, eph4 hücrelerini daha önce açıklanan ve trypsed hücrelerin intibakı sonrası tek hücre süspansiyonları sağlayarak farklılaşmaya hazırlanın. Sonra, bir hemositometre ile süspansiyon hücreleri saymak. Kuyu başına dört hücreye beş kez 10 tane aktarın ve beş dakika boyunca 250 kez g'de döndürün.Dikkatle supernatant orta aspire ve buz üzerinde tüp yerleştirin. Bir mililitrelik pipet ucu kullanın eph4 büyüme ortamının 350 mikrolitre hücreleri yeniden askıya almak için kullanın 20% matris ile takviye ederken buz üzerinde tüpler kabarcıklar önlemek için emin tutmak. Alt tabaka katılaştırıldıktan sonra, her kaplanmış iyi kaplanmış hücre süspansiyon 350 mikrolitre ekleyin ve bir saat için 37 derece santigrat bir karbondioksit inkübatör yerleştirin% 20 matris tabakası katılaşmak için izin vermek.Tek hücrelerin görünür olduğundan emin olmak için faz kontrast mikroskopisi ile hücreleri gözlemleyin. Daha sonra 200 mikrolitre EpH4 orta ve %10 matris ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Matristeki hücreleri kaplamaktan bir gün sonra farklılaşma indüksiyonuna başlayın.Dikkatle üst% 10 matris orta 150 mikrolitre çıkarın ve HIP ve% 10 matris içeren EpH4 orta 200 mikrolitre ekleyin ve kontroller için% 10 matris orta HIP olmadan ekleyin. Mamografi oluşumunu faz kontrastmikroskobu ile 10 güne kadar izleyerek ortamı iki günde bir değiştirin. Farklılaşmayı ölçmek için, %10 matris HIP ortamını kuyulardan dikkatlice inceleyin ve %20 matris katmanını 350 mikrolitre buz gibi pbs ile durulayın.Daha sonra 70 ila 100 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve bir milimolar EDTA ile doğrudan kuyulara ve %100 matrisin alt tabakasını pipet ucuyla hafifçe ayırın. Tabağı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede hafifçe sallayın. Spheroid süspansiyonu konik bir tüpe dikkatlice aktarın ve kalan küresel leri kurtarmak için kuyuları 500 mikrolitre PBS EDTA ile durulayın.Matrisin tamamen eridiğinden emin olmak için tüpü 30 dakika daha buz üzerinde sallayın. Görünür matris kümeleri görülürse, daha fazla PBS EDTA ekleyin veya daha uzun süre sallayın. Spheroidleri peletlemek için çözeltiyi 350 kez g'de santrifüj edin.Daha sonra supernatant aspire, küresel lyse, ve beta-kazein için hücreleri araştırmak, siklin D1, ve p120RasGAP Batı blotting tarafından. HC11 hücrelerinde Rac sinyalinin gücü üzerine farklılaşma çarpıcı bir bağımlılık vardır. Endojen CRAC1 farklılaşma için gerekli iken ve mutasyona aktive RacV12 düşük seviyelerde farklılaşma kapasitesinde bir artışa neden, yüksek RacV12 düzeyleri farklılaşma bir blok tetikler ve neoplazi neden.EpH4 hücrelerinin ayırım özellikleri 3Boyutlu matris kültüründe incelendiğinde, beta-kazein üretiminin 8-10 gün, siklin D1 ekspresyonunun ise HIP stimülasyonundan 4-6 gün sonra maksimum olduğu saptandı. Tek tek hücrelerin konumlandırılmasını belirlemek için DAPI ile boyanarak konfokal mikroskopi ile görüntülendiler. Memmosferlerde iç hücre ölümü ve içi boş lümen oluşumu gözlenirken, HGF eklenmesi tübüler yapıların oluşmasına neden oldu.Bu tekniği ilk kez yapan biri, HC11 hücrelerinin kaplamasının önemli olduğunu unutmamalıdır. Ayrıca eph4 hücrelerinin matristen doğru çıkarılması protein niceliği için çok önemlidir, çünkü herhangi bir kalıntı protein tayinini etkileyecektir. Bu teknik, benzer şekilde davranabilecek diğer sinyal dönüştürücülerini araştırmak için kullanılabilir.Bir kanser sürücü mutasyonları varsa, o zaman düşük seviyelerde kalan aslında farklılaşma neden olur bu yana onların tam inhibisyonu gerekli olmayacaktır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

NFKB Aktivite ve Meme Kanseri Kök Hücreler önler Sentezi ve bir Aspirin-fumarat ön-ilacının Karakterizasyonu

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

CRE-ifade Adenovirus fare mammary bezi içine bir Intraductal enjeksiyon yoluyla meme kanseri modelleme

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Meme Kanseri için Preklinik Modeller Olarak Meme Tümörlerinin Ortopedik Transplantasyonu

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...