Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

ويود المؤلفان ان يشكرا كلا من جان بيير باودوين واوليفييه مباريك علي مشورتهما وكلير اندرياني لمساعدتها في التصحيحات والتعديلات الانكليزيه. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من الدولة الفرنسية التي تديرها وكاله البحوث الوطنية في اطار برنامج "إينفيستيسيمينتس d'avenir (الاستثمارات من أجل المستقبل)" مع الاشاره ANR-10-اياهو-03 (عدوي البحر المتوسط) وبواسطة ريوجيون بروفانس الألب كوت دازور والتمويل الأوروبي FEDER PRIMI.

1. الأميبا الثقافة
<ol><li>استخدام فيرماميبا vermamoeba (سلاله CDC19) كدعم الخلية.</li>
	<li>أضافه 30 مل من البروتياز-peptone-استخراج الخميرة-الجلوكوز المتوسطة (PYG) (الجدول 1) و 3 مل من الأميبا في تركيز 1 × 106 خلايا/مل في 75 سم2 خليه ثقافة قارورة.</li>
	<li>الحفاظ علي الثقافة عند 28 درجه مئوية.</li>
...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

وتتوقف مده معالجه الاستنشاق الدقيق للخلية الواحدة وأداءها الجيد علي المشغل. تتطلب الخطوات المختلفة للتجربة الدقة. يجب ان يكون استخدام مكونات المعالجة التفصيلية لمحطه العمل تحت السيطرة المستمرة من خلال مراقبه عمليه الطموح المتناهي الصغر وإطلاق الخلية. والمتابعة بالرصد المجهري ضرورية لل...

الفيروسات الحمضية النووية الكبيرة النواة (NCLDV) متنوعة للغاية ، والتي تحددها أربع عائلات تصيب نواه النوى1. ووصفت الفيروسات الاولي مع الجينوم أعلاه 300 وكانت Phydcodnaviridae, بما في ذلك الفيروس بيرساريا شلوريلا باراسينيوم 1 PBCV12. العزلة والوصف الأول من Mimivirus ، وأظهرت ان حجم الفيروسات تضاعف من حيث حجم الجسيمات (450 نانومتر) وطول الجينوم (1.2 Mb)3. ومنذ ذلك الحين ، تم وصف العديد من الفيروسات العملاقة ، وعاده ما تكون معزولة باستخدام اجراء الأميبا الثقافة المشتركة. يمكن عزل العديد من الفيروسات العملاقة مع المتحولات المختلفة والمحتويات الوراثية من Acanthamoeba sp. الخلايا ، بما في ذلك مرسيليا ، الفيروسات Pandoraviruses ، الفيروسات ، الفيروسات ، الحمى الطفيلية ، الفيروسات ، ومؤخرا فيروس الورم النخاعي4،5،6،7،8،9،10،11،12، 13،14،15،16،17. في الوقت نفسه ، فان عزله vermamoeba vermamoeba يسمح العزلة ووصف الفيروسات العملاقة faustovirus ، kaumoebavirus ، و اورففيروس18،19،20. تم عزل الفيروسات العملاقة الأخرى مع الأطباء المضيفين ، مثل كافتيريا roenbergensis21، aureococcus أنوفاجيفيرينس22، تشريسوتشرومولينا اريك23، والقفطان بودو 24-الآن وكانت جميع هذه العزلات نتيجة لعدد متزايد من الفرق العاملة في العزل وإدخال تحديثات استراتيجية الانتاجيه العالية25،26،27،28، مثل تحسين نظام الثقافة المشتركة مع استخدام التدفق الخلوي.
في 2016 ، استخدمنا استراتيجية ربط الثقافة المشتركة وتدفق الخلوية لعزل الفيروسات العملاقة27. وقد وضعت هذه الاستراتيجية لزيادة عدد العينات الملقحة ، ولتنويع الأطباء الداعمين المستخدمين كدعامات للخلايا ، وللكشف بسرعة عن تحلل دعم الخلايا. تم تحديث النظام عن طريق أضافه خطوه اضافيه لتجنب تحديد البيولوجيا الجزيئية الاوليه والكشف السريع عن السكان الفيروسية غير معروف كما هو الحال في Pacmanvirus29. اقتران تدفق الخلوي لفرز الخلايا يسمح للفصل بين خليط من Mimivirus و Cedratvirus A1130. ومع ذلك ، واجهنا في وقت لاحق قيود الانفصال والكشف عن هذه السكان الفرعية الفيروسية عن طريق تدفق الخلوي. بعد التسلسل ، عندما جمعنا الجينوم من Faustovirus ST125 و FAUSTOVIRUS LCD7 (البيانات غير المنشورة) ، وجدنا بشكل مدهش في كل تجميع اثنين من الجينوم التكميلي لفيروسين جديدين لم يتم تحديدهما في قواعد بيانات الجينوم العام. ومع ذلك ، فان لا تدفق الخلوي ولا انتقال المجهر الكتروني (TEM) أظهرت ان الأميبا كانت مصابه بفيروسين مختلفين ، كلانديستينوفيروس ST1 و مغتصب الفيروسات LCD7. قمنا بتصميم أنظمه PCR محدده لتضخيم فوستوفيروس ، والفيروسات المغتصبة ، وعلامات كلانديستينوفيروس علي التوالي علي أساس الجينوم الخاصة بهم. كان هدفنا ان يكون النظام القائم علي PCR التي تمكن التحقق من نقاء الفيروسات التي يتم فصلها. ومع ذلك ، فشل التخفيف نقطه النهاية والتدفق الخلوي للفصل بينهما. وكانت عزله هذه المجموعة الفيروسية الوحيدة صعبه لأنه لم يتم وصف العناصر المورفولوجية والمستنسخة لكلانديستينوفيروس والسكان المغتصبين. اكتشفنا واحد فقط من السكان الفيروسية من خلال تدفق الخلوية بسبب تداخل السكان اثنين (اختبار بعد الانفصال الفعلي). حاولنا فصلهم باستخدام واحد الجسيمات الفرز علي لوحات 96-حسنا ، ولكن لم نلاحظ اي اثار خلوي ، واكتشفنا لا كلانديستينوفيروس ولا مغتصب الفيروسات بواسطة PCR التضخيم. وأخيرا ، لم يكن سوي مزيج من تخفيف نقطه النهاية تليها الأميبا الصغيرة الطموح الذي مكن الفصل بين هذين الفيروسات العملاقة منخفضه الوفرة من فوستوفيروس. هذا الأسلوب للفصل هو الكائن من هذه المقالة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

خلال عمليه الثقافة المشتركة الأميبا ، قد يتم عزل أكثر من فيروس واحد في بئر واحده. نحن في السابق حل هذه المسالة عن طريق تخفيف نقطه النهاية و/أو الفرز الخلية المنشطة (FACS) تطبيقها علي السكان الفيروسية. ومع ذلك ، عندما يكون للفيروسات في الخليط خصائص مورفولوجيك مماثله واحده من الفيروسات تتكاثر ببطء ، يتم اكتشاف وجود اثنين من الفيروسات في مرحله التجمع الجينوم والفيروسات لا يمكن فصلها لمزيد من التوصيف. ولحل هذه المشكلة ، قمنا بوضع اجراء أحادي الطموح للخلية يسمح بفصل واستنساخ فيروسات متشابهة للغاية. في هذا العمل ، نقدم كيف سمحت لنا هذه الاستراتيجية البديلة لفصل السكان الفرعيين الفيروسية الصغيرة من كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 ، والفيروسات العملاقة التي تنمو ببطء ولا تؤدي إلى تحلل الأميبا بالمقارنة مع التحللي وسريع النمو فوستوفيروس. وتم تقييم الرقابة علي النقاء بواسطة تضخيم جيني محدد ، وأنتجت فيروسات لمزيد من التوصيف.

الشفط الدقيق للخلايا الواحدة هو عمليه المعالجة الجزئية الأمثل في هذه المخطوطة (الشكل 1). تمكن هذه التقنية من التقاط الأميبا المدورة المصابة (الشكل 2ا) وإطلاقها في لوحه جديده تحتوي علي اميباي غير مصاب (الشكل 2). وهو نموذج وظيفي التي تن?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

هنا ، ونحن وصف خليه واحده الطموح الصغير طريقه للفصل بين الأميبا المصابة. [أين وردر تو] فصلت [سوببوبولايشن] فيروسية في [ فرماميبا] [فرميفورليس ] يعدي ب [فوستوفيروس] وحميات عملاقه مجهوله, طور نحن البروتوكول مفصل أدناه ويبرهن قدرته ان يفصل اثنان [لوو-فري] رواية فيروسات عملاقه.

خليه واحده الطموح الصغير كاستراتيجية بديله لفرز الخلايا المنشطة الفلورية لفصل خليط الفيروسات العملاقة

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Single Cell Micro-Aspiration هي طريقة لاستكمال التقنيات المختلفة المستخدمة في مجال علم الأحياء المجهرية بشكل عام وفي علم الفيروسات بشكل خاص. يمكن الإجابة على السؤال الرئيسي وحل المشاكل التي واجهتها خلال عزل الفيروسات العملاقة عن طريق فصل فيروس من خليط الفيروسية التي تقدم وفرة منخفضة الفيروس كما كان الحال بالنسبة للفيروسات دوران, فيروس clandisinal, وفيروس عزباتي من واحد آخر, وهو فاوستوفيروس, موجودة في وفرة عالية على أي حال. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا النهج في استخدام استراتيجية غير مباشرة.وهو يتألف من فصل واستنساخ المضيف المصاب للحصول على فصل الفيروسية. لذلك، هذا الأسلوب يراقب الخطوات المختلفة من التقاط إلى الإفراج عن الخلايا وتأكيد عملية الفرز عن طريق المراقبة المجهرية. وأخيراً، يُستخدم علم الأحياء الجزيئي لتأكيد الفرز والمجهر الإلكتروني لمراقبة الجسيمات الفيروسية المنفصلة.هذا النهج سوف يحل المشكلة الرئيسية لفصل الفيروس. وهو أمر محتمل لاستنساخ أميبا أو استنساخ بروتين بشكل عام. يجب على الشخص الذي يحاول استخدام هذه التقنية للمرة الأولى أن يكون صارما ودقيقا عند السيطرة على الضغط.عنصر التحكم المرئي ضروري لتأكيد التقاط والإفراج عن خلية واحدة فقط. استخدام فيرماومبا فيرميفورميس، سلالة CDC 19، كدعم الخلية. إضافة 30 ملليلتر من PYG المتوسطة وثلاثة ملليلتر من الأميبا بتركيز واحد من عشرة مرات إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر في قارورة ثقافة خلية 75 سم مربع.الحفاظ على ثقافة في 28 درجة مئوية في حاضنة. بعد 48 ساعة، نقل 10 ملليلترات من ثقافة خلية الأميبا إلى شريحة العد ووضعها تحت المجهر لتحديد كمية الأميبا. لشطف، حصاد 30 ملليلتر من ثقافة الخلية في أنبوب وبيليه الأميبا عن طريق الطرد المركزي في 720 مرات G لمدة 10 دقائق.إزالة افرنح و resuspend بيليه في حجم مناسب من التجويع المتوسطة للحصول على تركيز واحد مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. إعداد الدعم الخلوي مع إضافة عامل مضاد للميكروبات. في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، إضافة واحدة مرات 10 إلى السادسة من ثقافة الأميبا في مليلتر اثنين من وسط المجاعة.ثم تلقيح 100 ملليلتر من محلول الأسهم التي تحتوي على خليط من الفيروسات في الخلية الأميبا دعم ثقافة في تعدد العدوى من 0.01. احتضان الخلية الأميبا المصابة دعم الثقافة. إضافة 30 درجة مئوية لمدة 10 إلى 14 ساعة أو حتى يتم حث الآثار السيتوباثية مثل التقريب أميبال أو تحلل.بعد ذلك ، استخدم حقنة لجمع الوسائط ولتر من خلال مرشح خمسة ميكرون لإزالة الحطام الخلوي. تنفيذ تخفيف الحبوب من العينة الفيروسية في وسط المجاعة في آبار مختلفة. تلقيح مليلترين من مرة واحدة 10 إلى Vermamoba Vermaformis السادس الواردة في كل طبق بيتري مع 100 ملليلتر من الخليط inoculum.ثم، ضع أطباق بيتري في كيس بلاستيكي قابل للغلق عند 30 درجة مئوية. في ست ساعات بعد العدوى، ومراقبة أطباق بيتري مع المجهر البصري المقلوب وفحص مورفولوجيا الخلية كل أربع إلى ثماني ساعات. العلاج المضاد للميكروبات هو للدعم الخلوي.حدد من بين أطباق بيتري تلك التي تغيب عن أي تلوث بصري من قبل العوامل الفطرية والبكتيرية ومع أدلة على تأثير cytopathic من الأميبا بسبب الفيروسات ومع مرحلة ما قبل الانحلال وتدوير الأميبا لتجنب طموح الجسيمات الفيروسية. قم بإعداد محطة عمل مع جهاز التحكم اليدوي، وجهاز ضغط التحكم اليدوي، والمجهر المقلوب، ووحدات توصيل وتشغيل المحركات، والكاميرا، ووحدة الكمبيوتر. اختيار شعري صغير من 20 ميكرون القطر الداخلي للسماح لصيانة موقف داخلي والإفراج عن السهل من الخلية.إصلاح زاوية التشغيل لنظام تجتاح على وحدة بمحرك في 45 درجة. إجراء تثبيت مزدوج، أولا على نظام تجتاح ثم على شعري صغير. ركز على الخلايالاستنساخ الخلايا، ضع طبق بيتري الذي يحتوي على مليلترين من الأميبا المصابة تحت المجهر. التركيز أولا على الخلايا ثم على الشعرية الصغيرة مغمورة في الثقافة. قطف خلية واحدة مدورة و جلب الشعيرات الدموية الصغيرة أقرب إلى micromanipulator.بذل طموح لينة مع التحكم في الضغط اليدوي على الخلية الاستيلاء عليها داخل الشعرية الصغيرة إزالة الخلية واحدة من العينة الأولى والإفراج عنها في دعم ثقافة الخلية الأميبا. ثم احتضانه في 30 درجة مئوية. السيطرة بعناية على الضغط لتكون قادرة على التطلع خلية واحدة والسيطرة على طموحك من خلال مراقبة الإفراج عن خلية واحدة.إجراء ملاحظات يومية مع المجهر البصري المقلوب لمراقبة ظهور الخلايا ورصد ظهور تأثير cytopathic. الآن تشغيل نظام استخراج الآلي لاستخراج الحمض النووي من جزء من عينات الثقافة الإيجابية حيث لوحظ تأثير cytopathic. تصميم التمهيدي لتضخيم الجينات الفقيرة مشروحة كما RBP2 لفيروس فاوستو، البروتين الكبسي الرئيسي لفيروس الغاصب، والبروتين capsid طفيفة لفيروس Clandestino.تنفيذ PCR القياسية باستخدام ثيرموسيفير وفقا للمخطوطة. تنفيذ 20 ميكروليلترات من تفاعلات PCR مع 50 ميكرومولار من كل التمهيدي، 1X ماجستير ميكس، وrريبونوكليس المياه الحرة. تشغيل المنتجات PCR مع وصمة عار هلام الحمض النووي على هلام agarose 1.5٪ في الجهد من 135 فولت وتصور مع الأشعة فوق البنفسجية. هذا البروتوكول يحسن عملية micromanipulation مع طموح صغير خلية واحدة.هذه التقنية تمكن من التقاط الأميبا مدورة والمصابة وإطلاقها في لوحة رواية تحتوي على الأميبا غير المصابة. هذا النهج عزل بنجاح جديدة منخفضة الوفرة العملاقة فيروس اسمه Userpatvirus LCD7. وقد لوحظ فقط فيروس المستخدم الخاص بك في استنساخ سبعة مع وجود الحمض النووي المستخدم فيروس LCD7 وغياب الحمض النووي فيروس فاوستو.كشف المجهر الإلكتروني ظهور Clandestinovirus ST1، الذي يحتوي على مورفولوجيا نموذجية icosahedral دون fibrils وكذلك Usurpatvirus LCD7 مع capsid icosahedral من حوالي 250 نانومتر. انخفاض قياس استئصال الدم يؤكد تداخل مجموعات فيروس فاوستو ونوفوروس. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الإجراء بسهولة.أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو ضرورة وجود حد أدنى من الملاحظات الطقسية فيما يتعلق بحجم الكيانات مع حسن التعامل مع المختصين في محطة العمل والتحقق من أي مشكلة تلوث. ويمكن استخدام هذا النهج كتقنية فرز على أساس مورفولوجيا الخلية. حاليا يتم استخدامه في مختبرنا لاستنساخ الأميبا محددة.نقطة واحدة حرجة من هذه التقنية هو الحفاظ على سلامة الخلية. في الواقع، يمكن أن يكون لدينا بعض المشاكل مع عدم مراقبة الخلية أو الإفراج. ويرجع ذلك في الغالب إلى تفكك الخلية في الشعيرات الدموية الدقيقة.ويمكن أن تكون هذه الطريقة بديلا فعالا عندما لا يكون القياس عن بعد أو الفرز عن بعد غير متوفرين وعندما يتم التوصل إلى قيود تقنية محددة. لا ننسى أنه في بعض الحالات لا يتم تحرير الخلية من الشعرية الصغيرة. ويرجع ذلك جزئيا إلى خصائص الأميبا وقدرتها على التكيف ومن ثم من غشاء الخلية.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) التوسيم والفرز وبعد الإسفار خلية المنشط للتحديد ، ثقافة مستقلة عن العضوية الذائبة الكربون المهينة العوالق البكتيرية

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

عزل الخلايا الليفية عادي والسرطان يرتبط بها من الأنسجة الطازجة من الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

فلورسينس تنشيط فرز الخلايا لعزل سكان الخلايا Scleractinian

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...