Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke både Jean-Pierre Baudoin og Olivier Mbarek for deres råd og Claire Andréani for hendes hjælp i engelske rettelser og modifikationer. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra den franske stat, der forvaltes af det nationale forskningsagentur under programmet "Investissements d'avenir (investeringer for fremtiden)" med referencen ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée-infektion) og af Région Provence Alpes Côte d'Azur og europæisk finansiering af FEDER PRIMI.

1. amøbe kultur
<ol><li>Brug Vermamoeba vermiformis (stamme CDC19) som en celle støtte.</li>
	<li>Der tilsættes 30 ml protease-peptone-gærekstrakt-glukose medium (PYG) (tabel 1) og 3 ml af amobers i en koncentration på 1 x 106 celler/ml i en 75 cm2 -celle dyrknings kolbe.</li>
	<li>Vedligehold kulturen ved 28 °C.</li>
	<li>Efter 48 h, kvantificere amobers ved hjælp af tælle slides.</li>
	<li>For at skylle, høst cellerne i en koncentration på 1 x 106 c...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

Varigheden af enkelt cellens mikroaspirations håndtering og dens gode funktion er operatør afhængig. De forskellige trin i forsøget kræver præcision. Brugen af micromanipulation komponenter af arbejdsstationen skal være under konstant kontrol ved at observere processen med mikro-aspiration og frigivelse af cellen. Opfølgningen ved mikroskopisk observation er nødvendig for opsamling og overførsel af en celle. En erfaren operatør kan tage 1 til 2 timer at isolere 10 celler og genover føre dem en efter en afhæn...

Nukleocytoplasmic store DNA-vira (ncldv) er yderst forskelligartede, defineret af fire familier, der inficerer eukaryoter1. De første beskrevne vira med genomer over 300 KBP var Phydcodnaviridae, herunder paramecium Bursaria chlorella virus 1 PBCV12. Isolationen og den første beskrivelse af Mimivirus, viste, at størrelsen af vira fordoblet i forhold til både størrelsen af partiklen (450 nm) og længden af genomet (1,2 MB)3. Siden da, mange gigantiske vira er blevet beskrevet, normalt isoleret ved hjælp af en amøbe Co-kultur procedure. Flere gigantiske vira med forskellige morfologier og genetisk indhold kan isoleres fra Acanthamoeba Sp. celler, herunder Marseillevira, Pandoraviruser, Pithovira, Mollivirus, Cedratvira, Pacmanvirus, tupanvirus, og for nylig Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallelt hermed tillod isoleringen af vermamoeba vermiformen isolation og beskrivelse af de gigantiske vira faustovirus, kaumoebavirus og orpheovirus18,19,20. Andre gigantiske vira blev isoleret med deres vært protists, såsom cafeteria roenbergensis21, aureococcus anophagefferens22, chrysochromulina ericina23, og Bodo saltans 24. Alle disse isoleringer var resultatet af et stigende antal hold, der arbejder på isolation, og indførelsen af strategi opdateringer med høj dataoverførselshastighed25,26,27,28, såsom forbedring af co-kultur systemet med anvendelse af strømnings cytometri.
I 2016 brugte vi en strategi, der knytter Co-Culture og flow flowcytometri til at isolere gigantiske vira27. Denne strategi blev udviklet for at øge antallet af prøver inokuleret, at sprede protister anvendes som celle understøtninger, og til hurtigt at detektere lysis af celle støtte. Systemet blev opdateret ved at tilføje et supplerende trin for at undgå foreløbig molekylær biologi identifikation og hurtig påvisning af en ukendt viral population som i tilfælde af Pacmanvirus29. Koblings flow cytometri til celle sortering tilladt til adskillelse af en blanding af Mimivirus og Cedratvirus A1130. Men vi stødte senere på begrænsningerne ved adskillelse og påvisning af disse virale delpopulationer ved flow cytometri. Efter sekvensering, da vi samlet genomer af Faustovirus ST125 og FAUSTOVIRUS LCD7 (ikke offentliggjorte data), vi overraskende fundet i hver forsamling to supplerende genomer af to nye vira ikke er identificeret i offentlige genomdata baser. Imidlertid viste hverken strømnings cytometri eller transmissions elektronisk mikroskopi (TEM), at amoebaerne var inficeret med to forskellige vira, Clandestinovirus ST1 og Usurpativirus LCD7. Vi designede specifikke PCR-systemer til at forstærke Faustovirus, Usurpativirus og Clandestinovirus markører baseret på deres genomer; vores formål var at have PCR-baserede systemer, der muliggør verifikation af renheden af de vira, der adskilles. Men, end-punkt fortynding og flow cytometri undladt at adskille dem. Isolationen af denne enkelt virale befolkning var vanskelig, fordi hverken morfologien eller replikerende elementer af Clandestinovirus og Usurpativirus populationer er blevet karakteriseret. Vi opdagede kun én viral population ved flow cytometri på grund af overlapning af de to populationer (testet efter den effektive adskillelse). Vi forsøgte at adskille dem ved hjælp af en enkelt partikel sortering på 96-brønd plader, men vi observerer ikke nogen cytopatiske effekter, og vi opdagede hverken Clandestinovirus eller Usurpativirus ved PCR amplifikation. Endelig var det kun kombinationen af slutpunkt fortynding efterfulgt af enkelt amøbe mikro-aspiration, der gjorde det muligt adskillelse af disse to low-overflod Giant vira fra faustovira. Denne metode til adskillelse er genstand for denne artikel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

Under amøbe-samkulturprocessen kan mere end én virus isoleres i en enkelt brønd. Vi har tidligere løst dette problem ved slutpunkts fortynding og/eller fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) anvendt på den virale population. Men, når virus i blandingen har lignende morfologiske egenskaber og en af de vira multiplicerer langsomt, tilstedeværelsen af to vira opdages på stadiet af genom samling og vira kan ikke adskilles for yderligere karakterisering. For at løse dette problem, vi udviklet en enkelt celle mikro-aspiration procedure, der giver mulighed for adskillelse og kloning af meget lignende vira. I det nuværende arbejde præsenterer vi, hvordan denne alternative strategi tillod os at adskille de små virale subpopulationer af Clandestinovirus ST1 og Usurpativirus LCD7, gigantiske vira, der vokser langsomt og ikke fører til amoebal lysis i forhold til den lytiske og hurtigtvoksende Faustovirus. Renheds kontrol blev vurderet ved specifik genforstærkning, og der blev fremstillet vira til yderligere karakterisering.

Enkelt celle mikro-aspiration er en micromanipulation proces optimeret i dette manuskript (figur 1). Denne teknik muliggør opsamling af en afrundet, inficeret amøbe (figur 2a) og dens frigivelse i en ny plade, der indeholder uinficeret amobers (figur 2). Det er en funktionel prototype, der gælder for Co-kultur-systemet og har med succes isoleret ikke-lytiske gigantiske vira. Denne fremgangsmåde blev brugt for f?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Her beskriver vi en enkelt celle mikro-aspiration metode til adskillelse af inficerede amoebae. For at adskille virale subpopulationer i Vermamoeba vermiformis inficeret af Faustovira og ukendte gigantiske vira, vi udviklede protokollen nedenfor og viste sin evne til at adskille to lav-overflod roman Giant vira.

Enkelt celle mikro-aspiration som en alternativ strategi for fluorescens-aktiverede celle sortering for Giant virus blanding adskillelse

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Mikroaspiration med en enkelt celle er en metode til at supplere de forskellige teknikker, der anvendes inden for mikrobiologi i almindelighed og i virologi i særdeleshed. Det kunne besvare centrale spørgsmål og løse problemer under gigantiske vira isolation ved at adskille en virus fra en viral blanding præsenterer en lav overflod Virus, som det var tilfældet for omsætning virus, clandisinal virus, og uzibati virus fra en anden, som er Faustovirus, til stede i høj overflod alligevel. Den største fordel ved denne tilgang er anvendelsen af en indirekte strategi.Den består af adskillelse og kloning af den inficerede vært for at opnå en viral adskillelse. Så denne metode overvåger de forskellige trin fra fangst til frigivelse af celler og bekræfte sorteringsprocessen ved mikroskopisk observation. Endelig anvendes molekylærbiologi til at bekræfte sorteringen og den elektroniske mikroskopi for at observere de adskilte viruspartikler.Denne fremgangsmåde vil løse det store problem med virus separation. Det er en potentiel for kloning ameba eller kloning protists i almindelighed. Den person, der forsøger at bruge denne teknik for første gang skal være streng og præcis, når kontrollerende tryk.Den visuelle kontrol er afgørende for at bekræfte indfangning og frigivelse af kun én celle. Brug Vermamoeba Vermiformis, stamme CDC 19, som en celle støtte. Der tilsættes 30 milliliter PYG-medium og tre milliliter amøbe i en koncentration på en gang ti til de sjette celler pr. milliliter i en 75 kvadratcentimetercelle.Bevar kulturen ved 28 grader Celsius i en kuvøse. Efter 48 timer overføres 10 milliliter af amøbecellekulturen til et tælleslide og sættes under et mikroskop for at kvantificere amøbe. At skylle, høst 30 milliliter af cellekulturen i et rør og pellet amøbe ved centrifugering ved 720 gange G i 10 minutter.Supernatanten fjernes, og pelleten skal opbruges i et passende mængde sultemedium for at opnå en koncentration på en gang 10 til de sjette celler pr. milliliter. Forbered den cellulære støtte med tilsætning af antimikrobielt middel. I et biosikkerhedsskab skal du tilføje en gange 10 til den sjette amøbekultur i to milliliter sultemedium.Derefter vaccineres 100 milliliter af stamopløsningen, der indeholder blandingen af virus, i røgvævecellekulturstøtten ved en mangfoldighed af infektion på 0,01. Inkuber den inficerede amøbe cellekultur støtte. Tilføj 30 grader Celsius i 10 til 14 timer, eller indtil cytopatiske virkninger er induceret såsom amøbal afrunding eller lysis.Brug derefter en sprøjte til at indsamle mediet og filtrate gennem et fem mikronfilter for at fjerne cellulære snavs. Udfør en kornfortynding af den virale prøve i sultemedium i forskellige brønde. Isoler to milliliter en gange 10 til den sjette Vermamoba Vermaformis indeholdt i hver petriskål med 100 milliliter af blandingen inokulum.Derefter placere petriskåle i en forseglelig plastikpose ved 30 grader Celsius. På seks timer efter infektion, observere petriskåle med omvendt optisk mikroskopi og kontrollere celle morfologi hver fire til otte timer. Den antimikrobielle behandling er til den cellulære støtte.Vælg blandt petriskålene dem, der ikke er til stede ved visuel kontaminering med svampe- og bakteriemidler og med tegn på cytopatisk effekt af amøbe på grund af virus og med præ-lysis og afrundingsfasen af amøbe for at undgå aspiration af viruspartikler. Opret en arbejdsstation med mikromanipulator, manuel kontroltrykenhed, omvendt mikroskop, Plug and Play Motor-moduler, kamera og computermodul. Vælg en mikro kapillær på 20 mikron indre diameter for at tillade vedligeholdelse af en intern position og en nem frigivelse af cellen.Fastgør gribevinklen på det motoriserede modul ved 45 grader. Udfør en dobbelt installation, først på gribesystemet og derefter på mikro kapillær. Fokuser på cellerne.For at klone celler, placere petriskålen indeholder to milliliter inficeret amøbe under mikroskopet. Fokus først på cellerne og derefter på mikrokapillær nedsænket i kulturen. Picking afrundede enkelt celle og bringe mikro kapillær tættere på mikromanipulatoren.Anstrenge blød aspiration med manuel trykkontrol på cellen tager det inde i mikro kapillær Fjern enkeltcellen fra den første prøve og slip den i amøbe cellekultur støtte. Derefter inkubere det ved 30 grader Celsius. Kontroller forsigtigt trykket for at kunne stræbe efter en enkelt celle og styre din aspiration ved observation af frigivelsen af en enkelt celle.Udbet daglige observationer med et omvendt optisk mikroskop for at observere cellernes udseende og for at overvåge fremkomsten af den cytopatiske effekt. Betjen nu et automatiseret ekstraktionssystem til at udtrække DNA fra en del af de positive kulturprøver, hvor der observeres en cytopatisk effekt. Design primere til at forstærke fattige gener kommenteret som RBP2 for Faustovirus, større capsid protein til Usurpatvirus, og mindre capsid protein for Clandestinovirus.Udfør standard PCR ved hjælp af en termocyman i henhold til manuskriptet. Der udføres 20 mikrolilitere PCR-reaktioner med 50 mikromolar af hver primer, 1X Master Mix og ribonucleasefrit vand. Kør PCR produkter med DNA gel plet på en 1,5% agarose gel ved spændingen på 135 volt og visualisere med UV. Denne protokol optimerer en mikromanipulationsproces med mikroaspiration med en enkelt celle.Denne teknik gør det muligt at fange en afrundet og inficeret amøbe og dens udgivelse i en ny plade, der indeholder uinteret amøbe. Denne fremgangsmåde held isoleret en ny lav overflod kæmpe virus ved navn Userpatvirus LCD7. Din Userpatvirus blev kun observeret i klon syv med tilstedeværelse af Userpatvirus LCD7 DNA og fravær af Faustovirus DNA.Elektronmikroskopi afslørede udseendet af Clandestinovirus ST1, som har en typisk icosahedral morfologi uden fibrils samt Usurpatvirus LCD7 med en icosahedral capsid på omkring 250 nanometer. Lav cytometri bekræfter overlapning af populationer af Faustovirus og Nauvoirus. Når mestrer, kan denne procedure gøres nemt.Det vigtigste at huske, når man forsøger denne procedure, er nødvendigheden af et minimumsobservationsritual vedrørende størrelsen af enhederne med god håndtering af arbejdsstationens kompetente og kontrol af eventuelle forureningsproblem. Denne fremgangsmåde kan anvendes som sorteringsteknik på grundlag af cellemorfologi. I øjeblikket er det bruges i vores laboratorium til kloning af specifikke amøbe.Et kritisk punkt i denne teknik er at bevare cellens integritet. Faktisk kan vi have nogle problemer med den manglende observation af cellen eller frigivelse. Dette skyldes for det meste opløsningen af cellen i mikrokapillæren.Denne metode kan være et effektivt alternativ, når fejltelemetri og faktasortering ikke er tilgængelige, og når specifikke teknikbegrænsninger er nået. Glem ikke, at i nogle tilfælde cellen ikke frigives fra mikro kapillær. Dette skyldes til dels amøbe egenskaber og deres evne til at tilpasse sig og derefter fra cellemembranen.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosegelelektroforese til adskillelse af DNA fragmenter

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell specifik analyse af<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blade Med fluorescensaktiveret cellesortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolering af normale og cancer-associeret fibroblaster fra friske væv ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Single-celle Mikroinjektion for Cell Kommunikation Analyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi for følsomme, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

En alternativ metode til Sample Preparation med lav Cell Antal for TEM Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Fluorescensaktiveret cellesortering til isoleractiniske cellepopulationer

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...