Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

De auteurs willen zowel Jean-Pierre Baudoin als Olivier Mbarek bedanken voor hun advies en Claire Andréani voor haar hulp in Engelse correcties en aanpassingen. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Franse staat die werd beheerd door het nationaal onderzoeksbureau in het kader van het programma "Investissements d'avenir (Investments for the Future)" met de referentie ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée-infectie) en door de regio Provence-Alpes De Côte d'Azur en de Europese financiering FEDER PRIMI.

1. amoeba-cultuur
<ol><li>Gebruik Vermamoeba vermiformis (strain CDC19) als een celsteun.</li>
	<li>Voeg toe 30 ml protease-peptone-gistextract-glucose medium (pyg) (tabel 1) en 3 ml eencellige in een concentratie van 1 x 106 cellen/ml in een 75 cm2 celkweek kolf.</li>
	<li>Behoud de cultuur bij 28 °C.</li>
	<li>Na 48 h Kwantificeer je de eencellige met teldia's.</li>
	<li>Om te spoelen, oogst de cellen in een concentratie van 1 x 106 cellen/ml en pellet de ee...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

De duur van de eencellige behandeling met micro-aspiratie en de goede werking ervan is afhankelijk van de exploitant. De verschillende stappen van het experiment vereisen precisie. Het gebruik van de Micro manipulatie-onderdelen van het werkstation moet voortdurend worden bestreden door het proces van micro-aspiratie en het vrijkomen van de cel te observeren. De follow-up door microscopische observatie is noodzakelijk voor het vangen en overbrengen van een cel. Een ervaren operator kan 1 tot 2 uur duren om 10 cellen te i...

Nucleocytoplasmische grote DNA-virussen (NCLDV) zijn zeer divers, gedefinieerd door vier families die eukaryoten1infecteren. De eerste beschreven virussen met genomen boven 300 KBP waren phydcodnaviridae, waaronder Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. De isolatie en de eerste beschrijving van Mimivirus, toonde aan dat de grootte van de virussen verdubbeld in termen van zowel de grootte van het deeltje (450 nm) en de lengte van het genoom (1,2 MB)3. Sindsdien zijn veel reusachtige virussen beschreven, meestal geïsoleerd met behulp van een amoeba-co-cultuur procedure. Verschillende reusachtige virussen met verschillende morfologieën en genetische inhoud kunnen worden geïsoleerd uit Acanthamoeba SP. cellen, met inbegrip van Marseillevirussen, Pandoravirussen, Pithovirussen, Mollivirus, Cedratvirussen, Pacmanvirus, tupanvirus, en onlangs Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallel, de isolatie van vermamoeba vermiformis toegestaan de isolatie en de beschrijving van de gigantische virussen faustovirus, kaumoebavirus, en orpheovirus18,19,20. Andere reusachtige virussen werden geïsoleerd met hun gastheer protisten, zoals cafetaria roenbergensis21, aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, en Bodo saltans 24. Al deze isolaties waren het resultaat van een toenemend aantal teams die werkten aan isolatie en de introductie van een high-throughput strategie updates25,26,27,28, zoals de verbetering van het co-cultuur systeem met het gebruik van flow cytometrie.
In 2016 gebruikten we een strategie die co-cultuur en flow cytometrie aan het koppelen was om gigantische virussen27te isoleren. Deze strategie is ontwikkeld om het aantal geënt monsters te verhogen, om protisten te diversifiëren die worden gebruikt als celondersteuningen, en om snel de lysis van de celsteun te detecteren. Het systeem werd bijgewerkt door een aanvullende stap toe te voegen om voorlopige moleculaire biologie-identificatie en snelle detectie van een onbekende virale populatie te voorkomen, zoals in het geval van Pacmanvirus29. Koppelings stroom cytometrie naar celsortering toegestaan voor scheiding van een mengsel van Mimivirus en Cedratvirus A1130. Echter, we later ondervonden de beperkingen van de scheiding en detectie van deze virale subpopulaties doorstroming cytometrie. Na de sequencing, toen we de genomen van faustovirus ST125 en faustovirus LCD7 (niet-gepubliceerde gegevens) geassembleerd, we verrassend gevonden in elke vergadering twee aanvullende genomen van twee nieuwe virussen niet geïdentificeerd in het openbaar genoom databases. Echter, noch flow flowcytometrieonderzoeken noch transmissie elektronische microscopie (TEM) toonde aan dat de amoebaes werden geïnfecteerd door twee verschillende virussen, clandestinovirus ST1 en usurpativirus LCD7. We hebben specifieke PCR-systemen ontworpen om respectievelijk de markers van Faustovirus, Usurpativirus en Clandestinovirus te versterken op basis van hun Genomes; ons doel was om PCR-gebaseerde systemen te hebben die verificatie mogelijk maken van de zuiverheid van de virussen die worden gescheiden. Eindpunt verdunning en flow cytometrie echter niet om ze te scheiden. De isolatie van deze enkelvoudige virale populatie was moeilijk omdat noch de morfologie noch replicatieve elementen van Clandestinovirus en Usurpativirus populaties zijn gekenmerkt. We hebben slechts één virale populatie doorstroming cytometrie gedetecteerd vanwege de overlapping van de twee populaties (getest na de effectieve scheiding). We probeerden ze te scheiden met behulp van enkelvoudige deeltjes sortering op 96-well-platen, maar we hebben geen cytopathische effecten waargenomen, en we hebben geen Clandestinovirus of Usurpativirus gedetecteerd door PCR-versterking. Tot slot, het was alleen de combinatie van eindpunt verdunning gevolgd door enkele amoeba micro-aspiratie die de scheiding van deze twee laag-overvloed reus virussen van Faustovirussen ingeschakeld. Deze scheidingsmethode is het object van dit artikel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

Tijdens het cocultuurproces van amoeba kan meer dan één virus in één put worden geïsoleerd. We hebben dit probleem eerder opgelost door verdunning van het eindpunt en/of fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) toegepast op de virale populatie. Wanneer de virussen in het mengsel echter vergelijkbare morfologische eigenschappen hebben en een van de virussen langzaam vermenigvuldigt, wordt de aanwezigheid van twee virussen ontdekt in het stadium van genoom assemblage en kunnen de virussen niet worden gescheiden voor verdere karakterisering. Om dit probleem op te lossen, ontwikkelden we een eencellige micro-aspiratie procedure die het mogelijk maakt om sterk vergelijkbare virussen te scheiden en te klonen. In het huidige werk presenteren we hoe deze alternatieve strategie ons in staat stelde om de kleine virale subpopulaties van Clandestinovirus ST1 en Usurpativirus LCD7 te scheiden, gigantische virussen die langzaam groeien en niet leiden tot amoebal lysis in vergelijking met de lytische en snelgroeiende Faustovirus. De zuiverheids controle werd beoordeeld door specifieke genamplificatie en virussen werden geproduceerd voor verdere karakterisering.

Single cell micro-aspiratie is een Micro manipulatie proces dat is geoptimaliseerd in dit manuscript (Figuur 1). Deze techniek maakt het mogelijk om een afgeronde, geïnfecteerde amoeba (Figuur 2a) en de afgifte ervan in een nieuwe plaat met niet-geïnfecteerde eencellige (Figuur 2) vast te leggen. Het is een functioneel prototype dat van toepassing is op het co-cultuur systeem en heeft met succes geïsoleerde niet-...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Hier beschrijven we een enkele cel micro-aspiratie methode voor de scheiding van geïnfecteerde amoebae. Om virale subpopulaties te scheiden in Vermamoeba vermiformis geïnfecteerd door Faustovirussen en onbekende reus virussen, ontwikkelden we het protocol hieronder beschreven en toonden zijn vermogen om twee laag-overvloed roman reus virussen scheiden.

Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Single Cell Micro-Aspiration is een methode om de verschillende technieken die worden gebruikt op het gebied van microbiologie in het algemeen en in de virologie in het bijzonder aan te vullen. Het zou kunnen beantwoorden belangrijke vraag en problemen op te lossen ondervonden tijdens gigantische virussen isolatie door het scheiden van een virus van een virale mengsel presenteren een lage overvloed Virus zoals het geval was voor omzet virussen, clandisinal virus, en uzibati virus van een andere, dat is Faustovirus, aanwezig in hoge overvloed toch. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is het gebruik van een indirecte strategie.Het bestaat uit het scheiden en klonen van de geïnfecteerde gastheer om een virale scheiding te verkrijgen. Deze methode bewaakt dus de verschillende stappen van het vastleggen tot het vrijkomen van cellen en bevestigt het sorteerproces door microscopische observatie. Ten slotte wordt moleculaire biologie gebruikt om de sorteer- en elektronische microscopie te bevestigen om de gescheiden virale deeltjes te observeren.Deze aanpak zal het grootste probleem van virusscheiding oplossen. Het is een prospectieve voor het klonen van ameba of klonen protisten in het algemeen. De persoon die probeert om deze techniek te gebruiken voor de eerste keer moet rigoureus en nauwkeurig bij het beheersen van de druk.De visuele controle is essentieel om de opname en het vrijkomen van slechts één cel te bevestigen. Gebruik Vermamoeba Vermiformis, stam CDC 19, als celondersteuning. Voeg 30 milliliter PYG-medium en drie milliliter van de amoebe toe bij een concentratie van één maal tien tot de zesde cellen per milliliter in een celkweek van 75 vierkante centimeter.Houd de cultuur op 28 graden Celsius in een couveuse. Na 48 uur breng je 10 milliliter van de amoebecelcultuur over op een telplaat en leg je deze onder een microscoop om de amoebe te kwantificeren. Om te spoelen, oogst 30 milliliter van de celcultuur in een buis en pellet de amoebe door centrifugatie op 720 keer G gedurende 10 minuten.Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in het juiste volume van de hongerdroom om de concentratie van een keer 10 tot de zesde cellen per milliliter te verkrijgen. Bereid de cellulaire ondersteuning voor met de toevoeging van antimicrobiële agent. Voeg in een bioveiligheidskast één keer 10 toe aan de zesde amoebecultuur in twee milliliters hongermedium.Dan inenting 100 milliliter van de voorraad oplossing die het mengsel van virussen in de amoebecelcultuur te ondersteunen bij een veelheid van infectie van 0,01. Broed de geïnfecteerde amoebecelcultuur ondersteuning. Voeg 30 graden Celsius toe gedurende 10 tot 14 uur of totdat cytopathische effecten worden veroorzaakt, zoals amoebal afronding of lyse.Gebruik vervolgens een spuit om de media te verzamelen en filtrate door middel van een vijf micron filter om cellulaire puin te verwijderen. Voer een graanverdunning uit van het virale monster in verhongeringsmedium in verschillende putten. Inoculateert twee milliliter van één keer 10 tot de zesde Vermamoba Vermaformis in elke petrischaal met 100 milliliter van het mengsel entmateriaal.Plaats vervolgens de petrischaaltjes in een afsluitbare plastic zak op 30 graden Celsius. Observeer de petrischaaltjes na zes uur met omgekeerde optische microscopie en controleer de celmorfologie om de vier tot acht uur. De antimicrobiële behandeling is voor de cellulaire ondersteuning.Selecteer uit de petrischaaltjes degenen die afwezig zijn van een visuele besmetting door schimmel- en bacteriële agentia en met bewijs van cytopathisch effect van amoebe als gevolg van de virussen en met pre-lyse en afrondingsfase van de amoebe om aspiratie van virale deeltjes te voorkomen. Stel een werkstation in met micromanipulator, handmatig drukapparaat, omgekeerde microscoop, Plug and Play Motor-modules, camera en computermodule. Kies een micro capillair van 20 micron binnendiameter om het onderhoud van een interne positie en een gemakkelijke afgifte van de cel mogelijk te maken.Bevestig de bedieningshoek van het grijpsysteem op de gemotoriseerde module op 45 graden. Voer een dubbele installatie uit, eerst op het grijpsysteem en vervolgens op de micro capillaire. Focus op de cellen.Om cellen te klonen, plaats de petrischaal met twee milliliter geïnfecteerde amoebe onder de microscoop. Focus eerst op de cellen en vervolgens op de micro capillaire ondergedompeld in de cultuur. Het plukken van afgeronde eencellige en breng de micro capillaire dichter bij de micromanipulator.Oefen zachte aspiratie uit met handmatige drukcontrole op de cel die deze in de micro-capillaire neemt Verwijder de enkele cel uit het eerste monster en laat het los in de celcultuurondersteuning van de amoebe. Dan broeden op 30 graden Celsius. Controleer zorgvuldig de druk om een enkele cel te kunnen nastreven en controleer uw aspiratie door de waarneming van het vrijkomen van een enkele cel.Voer dagelijkse waarnemingen uit met een omgekeerde optische microscoop om het uiterlijk van de cellen te observeren en de opkomst van het cytopathische effect te monitoren. Gebruik nu een geautomatiseerd extractiesysteem om DNA te extraheren uit een deel van de positieve kweekmonsters waar een cytopathisch effect wordt waargenomen. Ontwerp primers om arme genen te versterken geannoteerd als RBP2 voor Faustovirus, belangrijke capsid eiwit voor Usurpatvirus, en kleine capsid eiwit voor Clandestinovirus.Voer standaard PCR uit met behulp van een thermocycler volgens het manuscript. Voer 20 microliliters pcr-reacties uit met 50 micromolar van elke primer, 1X Master Mix en ribonuclease gratis water. Voer de PCR-producten met DNA-gel vlek op een 1,5%agarose gel op de spanning van 135 volt en visualiseren met UV. Dit protocol optimaliseert een micromanipulatieproces met microaspiratie met één cel.Deze techniek maakt het vastleggen van een afgeronde en geïnfecteerde amoebe en de release ervan in een nieuwe plaat met niet-geïnfecteerde amoebe. Deze aanpak met succes geïsoleerd een nieuwe lage overvloed gigantische virus genaamd Userpatvirus LCD7. Uw Userpatvirus werd alleen waargenomen in kloon zeven met aanwezigheid van Userpatvirus LCD7 DNA en afwezigheid van Faustovirus DNA.Elektronenmicroscopie onthulde het uiterlijk van Het Clandestinovirus ST1, dat een typische icosahedralmorfologie zonder fibrils evenals Usurpatvirus LCD7 met een icosahedral capsid van ongeveer 250 nanometers heeft. Lage cytometrie bevestigt de overlapping van populaties van Faustovirus en Nauvoirus. Eenmaal onder de knie, kan deze procedure gemakkelijk worden gedaan.Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is de noodzaak van een minimale observatie ritueel met betrekking tot de grootte van de entiteiten met de goede behandeling van de bevoegde van het werkstation en de controle van eventuele verontreiniging probleem. Deze aanpak kan worden gebruikt als sorteertechniek op basis van celmorfologie. Momenteel wordt het gebruikt in ons laboratorium voor het klonen van specifieke amoebe.Een kritiek punt van deze techniek is het handhaven van de cel integriteit. Inderdaad, kunnen we een aantal problemen met de niet-observatie van de cel of release. Dit is vooral te wijten aan de desintegratie van de cel in de micro capillaire.Deze methode kan een efficiënt alternatief zijn wanneer fout telemetrie en fact sortering niet beschikbaar zijn en wanneer specifieke techniek beperkingen worden bereikt. Vergeet niet dat in sommige gevallen de cel niet wordt vrijgegeven uit de micro capillaire. Dit is deels te wijten aan de amoebe kenmerken en hun vermogen om zich aan te passen en vervolgens van het celmembraan.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Fluorescentie-geactiveerde celsorde voor de isolatie van scleractinische celpopulaties

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...