Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier à la fois Jean-Pierre Baudoin et Olivier Mbarek pour leurs conseils et Claire Andréani pour son aide dans les corrections et les modifications en anglais. Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Etat Français gérée par l'Agence Nationale de la Recherche dans le cadre du programme "Investissements d'avenir)" avec la référence ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée Infection) et par Région Provence Alpes Côte d'Azur et financement européen FEDER PRIMI.

1. Culture Amoeba
<ol><li>Utilisez Vermamoeba vermiformis (souche CDC19) comme support cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 30 ml de protéase-peptone-levure extrait-glucose milieu (PYG) (tableau 1) et 3 ml d'amibes à une concentration de 1 x 106 cellules/mL dans un flacon de culture cellulaire de 75 cm2.</li>
	<li>Maintenir la culture à 28 oC.</li>
	<li>Après 48 h, quantifier les amibes à l'aide de diapositives de comptage.</li>
	<li>Pour rincer, récolter les cellules à u...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

La durée de la manipulation de micro-aspiration à cellule unique et son bon fonctionnement dépendent de l'opérateur. Les différentes étapes de l'expérience exigent de la précision. L'utilisation des composants de micromanipulation du poste de travail doit être sous contrôle constant en observant le processus de micro-aspiration et la libération de la cellule. Le suivi par observation microscopique est nécessaire pour la capture et le transfert d'une cellule. Un opérateur expérimenté peut prendre 1 à 2 h p...

Les virus nucléocytoplasmiques de gros virus d'ADN (NCLDV) sont extrêmement divers, définis par quatre familles qui infectent des eucaryotes1. Les premiers virus décrits avec des génomes supérieurs à 300 kbp étaient Phydcodnaviridae, y compris Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. L'isolement et la première description de Mimivirus, a montré que la taille des virus a doublé en termes à la fois de la taille de la particule (450 nm) et la longueur du génome (1,2 Mo)3. Depuis lors, de nombreux virus géants ont été décrits, généralement isolés à l'aide d'une procédure de co-culture de l'amibe. Plusieurs virus géants avec des morphologies et des contenus génétiques différents peuvent être isolés à partir des cellules acanthamoeba sp., y compris les virus de Marseille, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, et récemment Médusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. En parallèle, l'isolement de Vermamoeba vermiformis a permis l'isolement et la description des virus géants Faustovirus, Kaumoebavirus, et Orpheovirus18,19,20. D'autres virus géants ont été isolés avec leurs protistes hôtes, tels que la cafétéria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, et Bodo saltans 24. Tous ces isolements sont le résultat d'un nombre croissant d'équipes travaillant sur l'isolement et de l'introduction de mises à jour de stratégie à haut débit25,26,27,28, telles que le l'amélioration du système de co-culture avec l'utilisation de la cytométrie de flux.
En 2016, nous avons utilisé une stratégie associant la co-culture et la cytométrie des flux pour isoler les virus géants27. Cette stratégie a été développée pour augmenter le nombre d'échantillons inoculés, pour diversifier les protistes utilisés comme supports cellulaires, et pour détecter rapidement la lyse du support cellulaire. Le système a été mis à jour en ajoutant une étape supplémentaire pour éviter l'identification préliminaire de la biologie moléculaire et la détection rapide d'une population virale inconnue comme dans le cas de Pacmanvirus29. La cytométrie de flux de couplage au tri cellulaire a permis la séparation d'un mélange de Mimivirus et cedratvirus A1130. Cependant, nous avons plus tard rencontré les limites de la séparation et de la détection de ces sous-populations virales par cytométrie de flux. Après le séquençage, lorsque nous avons assemblé les génomes du Faustovirus ST125 et du Faustovirus LCD7 (données non publiées), nous avons étonnamment trouvé dans chaque assemblage deux génomes supplémentaires de deux nouveaux virus non identifiés dans les bases de données du génome public. Cependant, ni la cytométrie de flux ni la microscopie électronique de transmission (TEM) n'ont montré que les amibes étaient infectées par deux virus différents, le clandestinovirus ST1 et l'usurpativirus LCD7. Nous avons conçu des systèmes PCR spécifiques pour amplifier les marqueurs de Faustovirus, d'Usurpativirus et de Clandestinovirus respectivement en fonction de leurs génomes ; notre but était d'avoir des systèmes basés sur PCR qui permettent de vérifier la pureté des virus séparés. Cependant, la dilution et la cytométrie de flux de point final n'ont pas réussi à les séparer. L'isolement de cette population virale unique a été difficile parce que ni la morphologie ni les éléments réplicateurs des populations de clandestinovirus et d'usurpativirus n'ont été caractérisés. Nous avons détecté une seule population virale par cytométrie de flux due au chevauchement des deux populations (testéeaprès la séparation effective). Nous avons essayé de les séparer à l'aide d'un seul tri de particules sur des plaques de 96 puits, mais nous n'avons observé aucun effet cytopathique, et nous n'avons détecté ni clandestinovirus ni usurpativirus par amplification PCR. Enfin, ce n'est que la combinaison de la dilution des points de terminaison suivie d'une seule micro-aspiration à l'amibe qui a permis la séparation de ces deux virus géants à faible abondance des Faustovirus. Cette méthode de séparation fait l'objet de cet article.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

Pendant le processus de co-culture de l'amibe, plus d'un virus peut être isolé dans un seul puits. Nous avons précédemment résolu ce problème par dilution de point final et/ou tri activé de cellules de fluorescence (FACS) appliqué à la population virale. Cependant, lorsque les virus dans le mélange ont des propriétés morphologiques similaires et que l'un des virus se multiplie lentement, la présence de deux virus est découverte au stade de l'assemblage du génome et les virus ne peuvent pas être séparés pour une autre caractérisation. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une procédure de micro-aspiration à cellule unique qui permet la séparation et le clonage de virus très similaires. Dans le présent travail, nous présentons comment cette stratégie alternative nous a permis de séparer les petites sous-populations virales de Clandestinovirus ST1 et Usurpativirus LCD7, virus géants qui se développent lentement et ne conduisent pas à la lyse amiale par rapport à la lytique et à croissance rapide Le Faustovirus. Le contrôle de pureté a été évalué par amplification spécifique de gène et des virus ont été produits pour davantage de caractérisation.

La micro-aspiration à cellule unique est un processus de micromanipulation optimisé dans ce manuscrit (figure 1). Cette technique permet la capture d'une amibe arrondie et infectée (figure 2A) et sa libération dans une nouvelle plaque contenant des amibes non infectées (figure 2). Il s'agit d'un prototype fonctionnel qui s'applique au système de co-culture et a réussi à isoler les virus géants non-lytiques....

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Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Ici, nous décrivons une méthode de micro-aspiration de cellules simples pour la séparation des amibes infectées. Afin de séparer les sous-populations virales de Vermamoeba vermiformis infectés par des Faustovirus et des virus géants inconnus, nous avons développé le protocole détaillé ci-dessous et démontré sa capacité à séparer deux nouveaux virus géants à faible abondance.

Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

La micro-aspiration à cellule unique est une méthode qui complète les différentes techniques utilisées dans le domaine de la microbiologie en général et de la virologie en particulier. Il pourrait répondre à la question clé et résoudre les problèmes rencontrés lors de l’isolement des virus géants en séparant un virus d’un mélange viral présentant un virus de faible abondance comme c’était le cas pour les virus de chiffre d’affaires, le virus clandisinal, et le virus uzibati d’un autre, qui est Faustovirus, présent en abondance élevée de toute façon. Le principal avantage de cette approche est l’utilisation d’une stratégie indirecte.Il consiste à séparer et clonage l’hôte infecté pour obtenir une séparation virale. Ainsi, cette méthode surveille les différentes étapes de la capture à la libération des cellules et confirme le processus de tri par observation microscopique. Enfin, la biologie moléculaire est utilisée pour confirmer le tri et la microscopie électronique pour observer les particules virales séparées.Cette approche résoudra le problème majeur de la séparation des virus. Il s’agit d’un potentiel pour le clonage ameba ou le clonage protists en général. La personne qui essaie d’utiliser cette technique pour la première fois doit être rigoureuse et précise lors du contrôle de la pression.Le contrôle visuel est essentiel pour confirmer la capture et la libération d’une seule cellule. Utilisez Vermamoeba Vermiformis, souche CDC 19, comme support cellulaire. Ajouter 30 millilitres de PYG moyen et trois millilitres de l’amibe à une concentration d’une fois dix à la sixième cellule par millilitre dans un flacon de culture cellulaire de 75 centimètres carrés.Maintenir la culture à 28 degrés Celsius dans un incubateur. Après 48 heures, transférer 10 millilitres de la culture cellulaire amibe sur une diapositive de comptage et le placer sous un microscope pour quantifier l’amibe. Pour rincer, récolter 30 millilitres de la culture cellulaire dans un tube et granuler l’amibe par centrifugation à 720 fois G pendant 10 minutes.Enlevez le supernatant et resuspendez la pastille dans le volume approprié de milieu de famine pour obtenir la concentration d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Préparer le soutien cellulaire avec l’ajout d’agent antimicrobien. Dans un cabinet de biosécurité, ajouter une fois 10 à la sixième de la culture amibe en deux millilitres de milieu de famine.Puis inoculer 100 millilitres de la solution de stock contenant le mélange de virus dans le soutien de la culture cellulaire amibe à une multiplicité d’infection de 0,01. Incuber le support de culture cellulaire amibe infecté. Ajouter 30 degrés Celsius pendant 10 à 14 heures ou jusqu’à ce que des effets cytopathiques soient induits comme l’arrondi amibal ou la lyse.Ensuite, utilisez une seringue pour recueillir les médias et filtrate à travers un filtre de cinq microns pour enlever les débris cellulaires. Effectuer une dilution céréalière de l’échantillon viral dans le milieu de famine dans différents puits. Inoculer deux millilitres d’une fois 10 à la sixième Vermamoba Vermaformis contenue dans chaque boîte de Pétri avec 100 millilitres du mélange inoculum.Ensuite, placez les boîtes de Petri dans un sac en plastique étanche à 30 degrés Celsius. À six heures après l’infection, observez les boîtes de Petri avec microscopie optique inversée et vérifiez la morphologie cellulaire toutes les quatre à huit heures. Le traitement anti-microbien est pour le soutien cellulaire.Choisissez parmi les boîtes de Pétri celles qui ne sont pas contaminées visuellement par des agents fongiques et bactériens et avec des preuves de l’effet cytopathique des amibeux dus aux virus et avec la phase de pré-lyse et d’arrondi de l’amibe pour éviter l’aspiration des particules virales. Installez un poste de travail avec micro manipulateur, dispositif de pression de commande manuelle, microscope inversé, modules Plug and Play Motor, caméra et module informatique. Choisissez un micro capillaire de 20 microns de diamètre intérieur pour permettre l’entretien d’une position interne et une libération facile de la cellule.Fixez l’angle de fonctionnement du système de préhension sur le module motorisé à 45 degrés. Effectuez une double installation, d’abord sur le système de préhension, puis sur le micro capillaire. Concentrez-vous sur les cellules.Pour cloner les cellules, placez la boîte de Pétri contenant deux millilitres d’amibe infecté sous le microscope. Concentrez-vous d’abord sur les cellules, puis sur le micro capillaire immergé dans la culture. Cueillir une seule cellule arrondie et rapprocher le micro capillaire du micromanipulateur.Exercez une aspiration douce avec un contrôle manuel de la pression sur la cellule qui la prend à l’intérieur du micro capillaire Retirez la cellule unique du premier échantillon et relâchez-la dans le support de culture cellulaire de l’amibe. Puis l’incuber à 30 degrés Celsius. Contrôlez soigneusement la pression pour être en mesure d’aspirer une seule cellule et de contrôler votre aspiration par l’observation de la libération d’une seule cellule.Effectuer des observations quotidiennes avec un microscope optique inversé pour observer l’apparence des cellules et surveiller l’émergence de l’effet cytopathique. Maintenant, utiliser un système d’extraction automatisé pour extraire l’ADN d’une partie des échantillons de culture positive où un effet cytopathique est observé. Concevoir des amorces pour amplifier les gènes pauvres annotés comme RBP2 pour Faustovirus, protéine capsidique majeure pour Usurpatvirus, et protéine capsid mineure pour clandestinovirus.Effectuez pcr standard à l’aide d’un thermocycleur selon le manuscrit. Effectuer 20 microlilitres de réactions PCR avec 50 micromolaires de chaque amorce, 1X Master Mix, et l’eau sans ribonuclease. Exécutez les produits PCR avec la tache de gel d’ADN sur un gel d’agarose de 1,5% à la tension de 135 volts et visualisez avec UV. Ce protocole optimise un processus de micromanipulation avec une micro aspiration à cellule unique.Cette technique permet la capture d’une amibe arrondie et infectée et sa libération dans une nouvelle plaque contenant des amibettes non infectées. Cette approche a réussi à isoler un nouveau virus géant à faible abondance nommé Userpatvirus LCD7. Votre Userpatvirus n’a été observé que dans le clone sept avec la présence de l’ADN userpatvirus LCD7 et l’absence d’ADN faustovirus.La microscopie électronique a indiqué l’aspect de Clandestinovirus ST1, qui a une morphologie icosahedral typique sans fibrilles aussi bien qu’Usurpatvirus LCD7 avec un capside icosahedral d’environ 250 nanomètres. Une faible cytométrie confirme le chevauchement des populations de Faustovirus et de Nauvoirus. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée facilement.La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est la nécessité d’un rituel d’observations minimales concernant la taille des entités avec la bonne manipulation des compétents du poste de travail et la vérification de tout problème de contamination. Cette approche peut être utilisée comme technique de tri sur la base de la morphologie cellulaire. Actuellement, il est utilisé dans notre laboratoire pour le clonage d’amibe spécifique.Un point critique de cette technique est de maintenir l’intégrité cellulaire. En effet, nous pouvons avoir quelques problèmes avec la non-observation de la cellule ou la libération. Ceci est dû principalement à la désintégration de la cellule dans le micro capillaire.Cette méthode pourrait être une alternative efficace lorsque la télémétrie des défauts et le tri des faits ne sont pas disponibles et lorsque des limitations techniques spécifiques sont atteintes. N’oubliez pas que dans certains cas, la cellule n’est pas libérée par le micro capillaire. Cela est dû en partie aux caractéristiques de l’amibe et à leur capacité d’adaptation, puis à partir de la membrane cellulaire.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

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Recherche

Biologie

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