Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Die Autoren danken sowohl Jean-Pierre Baudoin als auch Olivier Mbarek für ihren Rat und Claire Andréani für ihre Hilfe bei englischen Korrekturen und Modifikationen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des französischen Staates unterstützt, das von der Nationalen Forschungsagentur im Rahmen des Programms "Investissements d'avenir (Investitionen für die Zukunft)" mit der Referenz ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée Infection) und von Région Provence Alpes verwaltet wurde. Céte d'Azur und europäische Finanzierung FEDER PRIMI.

1. Amoeba Kultur
<ol><li>Verwenden Sie Vermamoeba vermiformis (Stamm CDC19) als Zellunterstützung.</li>
	<li>30 ml Protease-Pepton-Hefe-Extrakt-Glukosemedium (PYG)(Tabelle 1) und 3 ml Amöben in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml in einem 75 cm2 Zellkulturkolben hinzufügen.</li>
	<li>Pflegen Sie die Kultur bei 28 °C.</li>
	<li>Nach 48 h die Amöbe mit Zählfolien quantifizieren.</li>
	<li>Zum Spülen, Ernten Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 x 106...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

Die Dauer der einzelzelligen Mikroaspirationsbehandlung und ihre gute Funktion ist bedienerabhängig. Die verschiedenen Schritte des Experiments erfordern Präzision. Die Verwendung der Mikromanipulationskomponenten des Arbeitsplatzes muss durch die Beobachtung des Prozesses der Mikroaspiration und der Freisetzung der Zelle ständig kontrolliert werden. Die Nachbeobachtung durch mikroskopische Beobachtung ist für die Erfassung und Übertragung einer Zelle notwendig. Ein erfahrener Bediener kann 1 bis 2 h nehmen, um 10 Z...

Nukleozytoplasmatische große DNA-Viren (NCLDV) sind extrem vielfältig und werden von vier Familien definiert, die Eukaryote infizieren1. Die ersten beschriebenen Viren mit Genomen über 300 kbp waren Phydcodnaviridae, einschließlich Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 PBCV12. Die Isolierung und die erste Beschreibung des Mimivirus zeigten, dass sich die Größe der Viren sowohl in Bezug auf die Größe des Teilchens (450 nm) als auch auf die Länge des Genoms (1,2 Mb)3verdoppelte. Seitdem wurden viele Riesenviren beschrieben, die in der Regel mit einem Amöben-Co-Kulturverfahren isoliert werden. Mehrere Riesenviren mit unterschiedlichen Morphologien und genetischen Inhaltsstoffen können aus Acanthamoeba sp. Zellen isoliert werden, einschließlich Marseilleviren, Pandoraviren, Pithoviren, Mollivirus, Cedratviren, Pacmanvirus, Tupanvirus und vor kurzem Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallel dazu ermöglichte die Isolierung von Vermamoeba vermiformis die Isolierung und Beschreibung der Riesenviren Faustovirus, Kaumoebavirus und Orpheovirus18,19,20. Andere Riesenviren wurden mit ihren Wirtsprotisten isoliert, wie Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23und Bodo saltans 24. Alle diese Isolationen waren das Ergebnis einer wachsenden Anzahl von Teams, die an der Isolation arbeiten, und der Einführung von Strategieaktualisierungen mit hohem Durchsatz25,26,27,28, wie z. B. Verbesserung des Cokultursystems durch den Einsatz von Durchflusszytometrie.
Im Jahr 2016 haben wir eine Strategie verwendet, die Co-Kultur und Durchflusszytometrie assoziiert, um Riesige Viren zu isolieren27. Diese Strategie wurde entwickelt, um die Anzahl der geimpften Proben zu erhöhen, Protisten, die als Zellstützen verwendet werden, zu diversifizieren und die Lyse der Zellunterstützung schnell zu erkennen. Das System wurde durch hinzufügen eines zusätzlichen Schritts aktualisiert, um eine vorläufige molekularbiologische Identifizierung und schnellen Nachweis einer unbekannten Viruspopulation wie im Fall von Pacmanvirus29zu vermeiden. Die Kopplung der Durchflusszytometrie zur Zellsortierung ermöglichte die Trennung einer Mischung aus Mimivirus und Cedratvirus A1130. Später stießen wir jedoch auf die Grenzen der Trennung und Detektion dieser viralen Subpopulationen durch Durchflusszytometrie. Nach der Sequenzierung, als wir die Genome des Faustovirus ST125 und des Faustovirus LCD7 (unveröffentlichte Daten) zusammenstellten, fanden wir in jeder Baugruppe überraschenderweise zwei zusätzliche Genome von zwei neuartigen Viren, die in öffentlichen Genomdatenbanken nicht identifiziert wurden. Weder die Durchflusszytometrie noch die transmissionselektronische Mikroskopie (TEM) zeigten jedoch, dass die Amöben mit zwei verschiedenen Viren infiziert waren, dem Clandestinovirus ST1 und dem Usurpativirus LCD7. Wir haben spezielle PCR-Systeme entwickelt, um Faustovirus, Usurpativirus und Clandestinovirus-Marker auf der Grundlage ihrer Genome zu verstärken; Unser Ziel war es, PCR-basierte Systeme zu haben, die eine Überprüfung der Reinheit der zu trennenden Viren ermöglichen. Die Endpunktverdünnung und die Durchflusszytometrie konnten sie jedoch nicht trennen. Die Isolierung dieser einzelnen Viruspopulation war schwierig, da weder die Morphologie noch die replizierenden Elemente der Populationen des Clandestinovirus und des Usurpativirus charakterisiert wurden. Wir haben aufgrund der Überlappung der beiden Populationen (getestet nach der effektiven Trennung) nur eine Viruspopulation durch Durchflusszytometrie festgestellt. Wir haben versucht, sie mit einer einzigen Partikelsortierung auf 96-Well-Platten zu trennen, aber wir haben keine zytopathischen Effekte beobachtet, und wir haben weder Clandestinovirus noch Usurpativirus durch PCR-Verstärkung entdeckt. Schließlich war es nur die Kombination der Endpunktverdünnung gefolgt von einem einzigen Amöben-Mikro-Aspiration, die die Trennung dieser beiden mit geringer Häufigkeit reichenden Riesenviren von Faustoviren ermöglichte. Diese Trennungsmethode ist Gegenstand dieses Artikels.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

Während des Amöben-Cokulturprozesses kann mehr als ein Virus in einem einzigen Brunnen isoliert werden. Wir haben dieses Problem zuvor durch Endpunktverdünnung und/oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gelöst, die auf die Viruspopulation angewendet wurde. Wenn die Viren in der Mischung jedoch ähnliche morphologische Eigenschaften haben und sich eines der Viren langsam vermehrt, wird das Vorhandensein von zwei Viren im Stadium der Genom-Montage entdeckt und die Viren können nicht für eine weitere Charakterisierung getrennt werden. Um dieses Problem zu lösen, haben wir ein einzelliges Mikro-Aspirationsverfahren entwickelt, das die Trennung und das Klonen von sehr ähnlichen Viren ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit stellen wir vor, wie diese alternative Strategie es uns ermöglichte, die kleinen viralen Subpopulationen des Clandestinovirus ST1 und des Usurpativirus LCD7 zu trennen, Riesenviren, die langsam wachsen und nicht zu Amöbenlyse im Vergleich zu der lytischen und schnell wachsenden Faustovirus. Die Reinheitskontrolle wurde durch spezifische Genverstärkung bewertet und Viren für die weitere Charakterisierung produziert.

Die Einzelzell-Mikro-Aspiration ist ein in diesem Manuskript optimierter Mikromanipulationsprozess (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht die Erfassung einer abgerundeten, infizierten Amöbe (Abbildung 2A) und deren Freisetzung in einer neuartigen Platte, die nicht infizierte Amöben enthält (Abbildung 2). Es ist ein funktionaler Prototyp, der für das Co-Kultur-System gilt und erfolgreich nicht-lytische Riesenvi...

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Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Hier beschreiben wir eine einzellige Mikro-Aspirationsmethode zur Trennung infizierter Amöben. Um virale Subpopulationen in Vermamoeba vermiformis zu trennen, die mit Faustoviren und unbekannten Riesenviren infiziert sind, haben wir das unten beschriebene Protokoll entwickelt und seine Fähigkeit demonstriert, zwei neuartige Riesenviren mit geringem Überfluss zu trennen.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Single Cell Micro-Aspiration ist eine Methode zur Ergänzung der verschiedenen Techniken, die im Bereich der Mikrobiologie im Allgemeinen und in der Virologie im Besonderen eingesetzt werden. Es könnte Schlüsselfragen beantworten und Probleme lösen, die während der Isolierung von Riesenviren auftreten, indem es ein Virus von einer Virusmischung trennt, die eine geringe Überflussmenge virus, wie es der Fall für Umsatzviren, Clandisinal-Virus und Uzibati-Virus von einem anderen war, das Faustovirus, in großer Fülle sowieso vorhanden war. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Verwendung einer indirekten Strategie.Es besteht aus der Trennung und dem Klonen des infizierten Hosts, um eine virale Trennung zu erhalten. Diese Methode überwacht also die verschiedenen Schritte von der Erfassung bis zur Freisetzung von Zellen und bestätigt den Sortierprozess durch mikroskopische Beobachtung. Schließlich wird die Molekularbiologie verwendet, um die Sortierung und elektronische Mikroskopie zu bestätigen, um die getrennten Viruspartikel zu beobachten.Dieser Ansatz wird das Hauptproblem der Virustrennung lösen. Es ist eine Prospektin für das Klonen von Ameba oder Klonprotisten im Allgemeinen. Die Person, die versucht, diese Technik zum ersten Mal zu verwenden, muss bei der Druckkontrolle rigoros und präzise sein.Die visuelle Kontrolle ist wichtig, um die Erfassung und Freisetzung von nur einer Zelle zu bestätigen. Verwenden Sie Vermamoeba Vermiformis, Sorte CDC 19, als Zellunterstützung. Fügen Sie 30 Milliliter PYG Medium und drei Milliliter der Amöbe in einer Konzentration von ein mal zehn zu den sechsten Zellen pro Milliliter in einem 75 Quadratzentimeter Zellkulturkolben hinzu.Bewahren Sie die Kultur bei 28 Grad Celsius in einem Inkubator. Nach 48 Stunden 10 Milliliter der Amöbenzellkultur auf eine Zählrutsche übertragen und unter ein Mikroskop stellen, um die Amöbe zu quantifizieren. Zum Spülen 30 Milliliter der Zellkultur in einem Rohr ernten und die Amöbe durch Zentrifugation bei 720 mal G 10 Minuten pellet.Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet im entsprechenden Volumen des Hungermediums wieder auf, um die Konzentration von einem mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter zu erhalten. Bereiten Sie die zelluläre Unterstützung mit der Zugabe von antimikrobiellen Mitteln vor. In einem Biosicherheitsschrank ein mal 10 zu dem sechsten amöben Kultur in zwei Milliliter Hungermedium hinzufügen.Dann impfen 100 Milliliter der Stammlösung, die die Mischung von Viren in die Amöbenzellkultur unterstützen bei einer Vielzahl von Infektionen von 0,01. Inkubieren Sie die infizierte Amöbenzellkultur Unterstützung. Fügen Sie 30 Grad Celsius für 10 bis 14 Stunden hinzu oder bis zytopathische Effekte wie Amöbenrundung oder Lyse induziert werden.Als nächstes verwenden Sie eine Spritze, um die Medien zu sammeln und filtrat durch einen Fünf-Mikron-Filter, um Zellabfall zu entfernen. Führen Sie eine Getreideverdünnung der Virusprobe im Hungermedium in verschiedenen Brunnen durch. Impfen Sie zwei Milliliter von einem mal 10 bis zum sechsten Vermamoba Vermaformis, die in jeder Petrischale mit 100 Millilitern der Mischung Inoculum enthalten sind.Dann legen Sie die Petri-Gerichte in eine verschließbare Plastiktüte bei 30 Grad Celsius. Nach der Infektion sechs Stunden nach der Infektion die Petrischalen mit invertierter optischer Mikroskopie beobachten und alle vier bis acht Stunden die Zellmorphologie überprüfen. Die antimikrobielle Behandlung ist für die zelluläre Unterstützung.Wählen Sie unter den Petri-Schalen die, die keine visuelle Kontamination durch Pilz- und Bakterienmittel und mit Nachweis der zytopathischen Wirkung von Amöben aufgrund der Viren und mit Prälyse und Rundungsphase der Amöben, um das Streben von viralen Partikeln zu vermeiden. Richten Sie einen Arbeitsplatz mit Mikromanipulator, manuellem Steuerdruckgerät, invertiertem Mikroskop, Plug & Play Motormodulen, Kamera und Computermodul ein. Wählen Sie eine Mikrokapillare von 20 Mikron Innendurchmesser, um die Abergung einer inneren Position und eine einfache Freisetzung der Zelle zu ermöglichen.Fixieren Sie den Betriebswinkel des Greifsystems am motorisierten Modul auf 45 Grad. Führen Sie eine Doppelinstallation durch, zuerst auf dem Greifsystem und dann auf der Mikrokapillare. Konzentrieren Sie sich auf die Zellen.Um Zellen zu klonen, legen Sie die Petrischale mit zwei Millilitern infizierter Amöben unter das Mikroskop. Konzentrieren Sie sich zuerst auf die Zellen und dann auf die Mikrokapillare, die in die Kultur eingetaucht ist. Kommissionieren Sie abgerundete Einzelzellen und bringen Sie die Mikrokapillare näher an den Mikromanipulator.Üben Sie weiche Aspiration mit manueller Druckkontrolle auf die Zelle, die sie innerhalb der Mikrokapillare nimmt Entfernen Sie die Einzelzelle aus der ersten Probe und lassen Sie sie in der Zellkulturunterstützung der Amöben frei. Dann bebrüten Sie es bei 30 Grad Celsius. Kontrollieren Sie sorgfältig den Druck, um eine einzelne Zelle anstreben zu können, und steuern Sie Ihre Aspiration durch die Beobachtung der Freisetzung einer einzelnen Zelle.Führen Sie tägliche Beobachtungen mit einem invertierten optischen Mikroskop durch, um das Aussehen der Zellen zu beobachten und die Entstehung des zytopathischen Effekts zu überwachen. Betreiben Sie nun ein automatisiertes Extraktionssystem, um DNA aus einem Teil der positiven Kulturproben zu extrahieren, in dem eine zytopathische Wirkung beobachtet wird. Entwerfen Sie Primer, um schlechte Gene zu verstärken, die als RBP2 für das Faustovirus, das Hauptcapsidprotein für das Usurpatvirus und das kleinere Capsid-Protein für das Clandestinovirus bezeichnet werden.Führen Sie Standard-PCR mit einem Thermocycler gemäß dem Manuskript. Führen Sie 20 Mikroliliter von PCR-Reaktionen mit 50 Mikromolaren pro Primer, 1X Master Mix und Ribonuklease-freiem Wasser durch. Führen Sie die PCR-Produkte mit DNA-Gel-Färbung auf einem 1,5%Agarose-Gel bei einer Spannung von 135 Volt und visualisieren Sie mit UV. Dieses Protokoll optimiert einen Mikromanipulationsprozess mit einzelligem Mikroanspruch.Diese Technik ermöglicht die Erfassung einer abgerundeten und infizierten Amöbe und deren Freisetzung in einer neuartigen Platte, die nicht infizierte Amöben enthält. Dieser Ansatz isolierte erfolgreich einen neuen Riesenvirus mit geringer Häufigkeit namens Userpatvirus LCD7. Ihr Userpatvirus wurde nur in Klon sieben mit Anwesenheit von Userpatvirus LCD7 DNA und Abwesenheit von Faustovirus DNA beobachtet.Die Elektronenmikroskopie zeigte das Auftreten des Clandestinovirus ST1, das eine typische ikosaedrale Morphologie ohne Fibrillen sowie das Usurpatvirus LCD7 mit einem Icosahedral-Capsid von etwa 250 Nanometern hat. Niedrige Zytometrie bestätigt die Überlappung der Populationen von Faustovirus und Nauvoirus. Einmal gemeistert, kann diese Prozedur leicht durchgeführt werden.Das Wichtigste, was man beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollte, ist die Notwendigkeit eines Minimalbeobachtungsrituals über die Größe der Einheiten mit der guten Handhabung des zuständigen Arbeitsplatzes und der Kontrolle von Kontaminationsproblemen. Dieser Ansatz kann als Sortiertechnik auf der Grundlage der Zellmorphologie verwendet werden. Derzeit wird es in unserem Labor zum Klonen bestimmter Amöben eingesetzt.Ein kritischer Punkt dieser Technik ist die Aufrechterhaltung der Zellintegrität. In der Tat können wir einige Probleme mit der Nichtbeobachtung der Zelle oder Freisetzung haben. Dies ist vor allem auf den Zerfall der Zelle in die Mikrokapillare zurückzuführen.Diese Methode könnte eine effiziente Alternative sein, wenn Fehlertelemetrie und Faktensortierung nicht verfügbar sind und bestimmte technische Einschränkungen erreicht werden. Vergessen Sie nicht, dass die Zelle in einigen Fällen nicht aus der Mikrokapillare freigesetzt wird. Dies ist zum Teil auf die Amöben-Eigenschaften und ihre Anpassungsfähigkeit und dann von der Zellmembran zurückzuführen.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Forschung

Biologie

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling und anschließende Fluorescence Activated Cell Sorting für Kultur-unabhängige Identifizierung von gelöstem organischem Kohlenstoff abbauenden Bakterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...