Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

המחברים רוצים להודות גם לג פייר בודואן ולאוליביה מבארק על העצה שלהם ועל קלייר אנדראני על עזרתה בתיקונים ושינויים באנגלית. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמדינה הצרפתית מנוהלת על ידי סוכנות המחקר הלאומית תחת "מחקר השקעות לעתיד" התוכנית עם התייחסות ANR-10-IAHU-03 (זיהום מסיבי) ועל ידי Région פרובנס אלפ קוט ד'אזור והמימון האירופאי פדר PRIMI.

1. אמבה התרבות
<ol><li>השתמש Vermamoeba vermiformis (זן CDC19) כתמיכה תא.</li>
	<li>הוסף 30 מ ל של פרוטאז-peptone-שמרים לחלץ-גלוקוז בינוני (שולחן 1) ו 3 מ ל אמבות בריכוז של 1 x 106 תאים/mL ב 75 ס מ2 תרבות התא בקבוקון.</li>
	<li>שמור על התרבות ב -28 ° c.</li>
	<li>לאחר 48 h, מכמת את האמבות באמצעות ספירת שקופיות.</li>
	<li>?...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

משך הטיפול במיקרו-שאיפה התא היחיד ותפקודו התקין הוא תלוי-מרכזיה. השלבים השונים של הניסוי דורשים דיוק. השימוש ברכיבי המיקרומניפולציה של תחנת העבודה חייב להיות תחת שליטה מתמדת על-ידי התבוננות בתהליך של שאיפה מיקרו ושחרורו של התא. המעקב אחר התבוננות מיקרוסקופית הוא הכרחי ללכידה והעברה של תא...

נוקלאוציטופטוצימיק וירוסי DNA גדולים (NCLDV) הם מגוונים ביותר, המוגדרים על ידי ארבע משפחות להדביק eukaryotes1. הווירוסים הראשונים שתוארו עם גנום מעל 300 kbp היו phyd,כולל הנגיף כלורלה בורסאריה 1 PBCV12. הבידוד והתיאור הראשון של Mimivirus, הראה כי הגודל של וירוסים הוכפל במונחים של גודל של החלקיק (450 ננומטר) ואת אורך הגנום (1.2 Mb)3. מאז, וירוסים ענקיים רבים תוארו, בדרך כלל מבודדים באמצעות שיתוף תרבות אמבה הליך. כמה וירוסים ענקיים עם מורפולוגיות שונות ותכנים גנטיים יכולים להיות מבודדים מתאי האקאטאמבה sp., כולל Marseilleviruses, פנדוראוירוסים, Pithoviruses, Mollivirus ירוס, Cedratviruses, Pacmanvirus ירוס, tupanvirus, ולאחרונה וירוס4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. במקביל, הבידוד של vermamoeba vermiformis מותר בידוד ותיאור של וירוסים ענקיים faustovirus, kaumoebavirus, ו orpheovirus18,19,20. וירוסים ענקיים אחרים היו מבודדים עם protists המארחים שלהם, כגון קפטריה roenbergensis21, האוראוקוקוס anopהגאולה22, כריזוכרומלינה אבינה23, ו bodo saltans . עשרים וארבע כל הבודדים האלה היו תוצאה של מספר גדל והולך של צוותים העובדים על בידוד והמבוא של עדכוני אסטרטגיית תפוקה גבוהה25,26,27,28, כגון ה שיפור של מערכת שיתוף התרבות עם השימוש של cy, הזרמת הזרימה.
ב 2016, השתמשנו אסטרטגיה שיוך שיתוף התרבות והזרימה cy, נסה לבודד וירוסים ענקיים27. אסטרטגיה זו פותחה כדי להגדיל את מספר הדגימות מחוסן, כדי לגוון הפרולנים המשמשים כתומך התא, וכדי לזהות במהירות את הליזה של תמיכת התא. המערכת עודכנה על ידי הוספת צעד משלים כדי למנוע זיהוי ראשוני הביולוגיה המולקולרית וזיהוי מהיר של אוכלוסיה נגיפית לא ידוע כמו במקרה של Pacmanvirus29. הזיווגים זרימה cy, לנסות מיון התא מותר להפרדה של תערובת של Mimivirus ו Cedratvirus A1130. עם זאת, נתקלנו מאוחר יותר במגבלות של הפרדה וגילוי של אוכלוסיות משנה ויראליות אלה על ידי זרימה cy, לנסות. לאחר ברצף, כאשר הרכבנו את גנום של faustovirus ST125 ו faustovirus LCD7 (נתונים שלא פורסמו), אנו מוצאים במפתיע בכל הרכבה שני גנום משלים של שני וירוסים רומן לא מזוהה במסדי נתונים הגנום הציבורי. עם זאת, לא להזרים cy, או מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) הראו כי האמבות היו נגועים על ידי שני וירוסים שונים, ST1 הנגיף ו לחאבפטיב LCD7. עיצבנו מערכות PCR ספציפיות כדי להגביר את הנגיף, את הנגיף ואת סמני הפינווירוס בהתאמה על בסיס הגנום שלהם; המטרה שלנו הייתה לקבל מערכות מבוססות PCR המאפשרות אימות של טוהר הווירוסים המופרדים. עם זאת, דילול הנקודה הסופית והזרימה cyאני try לא הצליחו להפריד ביניהם. הבידוד של האוכלוסייה הנגיפית היחידה הזאת היה קשה משום שלא התאפיין במרכיבים מורפולוגיה ולא מרכיבים מחקריים של אוכלוסיות הנגיף והליפאיות. גילינו רק אוכלוסייה אחת ויראלית על ידי זרימה cy, לנסות בגלל חופפים של שתי האוכלוסיות (נבדק לאחר ההפרדה האפקטיבית). ניסינו להפריד ביניהן באמצעות מיון חלקיקים אחד על 96-צלחות, אבל לא הבחנו בשום השפעות סייטואטמית, ולא גילינו את ההשפעות השליליות של הנגיף או החאפיפטיו על ידי ה-PCR. לבסוף, זה היה רק שילוב של דילול נקודת הקצה ואחריו אמבה מיקרו-שאיפה אחת הזמינה הפרדה של שני אלה נמוכה שפע וירוסים ענקיים מן פאוסטוירוסים. שיטת הפרדה זו היא האובייקט של מאמר זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

במהלך התהליך שיתוף תרבות אמבה, יותר מווירוס אחד יכול להיות מבודד באר אחת. בעבר פתרנו את הבעיה הזאת באמצעות דילול נקודת הסיום ו/או מיון התא המופעל על ידי הזריחה (FACS) שהוחלו על האוכלוסייה הנגיפית. עם זאת, כאשר וירוסים בתערובת יש תכונות דומות מורפולוגיים ואחד הווירוסים מכפיל לאט, הנוכחות של שני וירוסים מתגלה בשלב של הרכבת הגנום והווירוסים לא ניתן להפריד לאפיון נוסף. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו תא בודד השאיפה מיקרו הליך המאפשר הפרדה ושיבוט של וירוסים דומים מאוד. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים כיצד אסטרטגיה חלופית זו אפשרה לנו להפריד את האוכלוסיות הקטנות ויראליות של הST1 וירוס מLCD7, וירוסים ענקיים הגדלים לאט ואינם מובילים לליזה אמבות בהשוואה לליטיק ולגידול מהיר . וירוס פאוסטוו בקרת טוהר הוערך על ידי הגברה גנטית ספציפיים ווירוסים יוצרו לאפיון נוסף.

מיקרו-שאיפה תא יחיד הוא תהליך מיקרומניפולציה הממוטב בכתב יד זה (איור 1). טכניקה זו מאפשרת לכידת של אמבה מעוגל, נגוע (איור 2א) ושחרורו בלוח הרומן המכיל אמבות נגוע (איור 2). זהו אב-טיפוס פונקציונלי שחלה על מערכת התרבות המשותף והיא מבודדת ?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

כאן, אנו מתארים שיטת מיקרו-השאיפה תא אחד להפרדה של אמבות נגוע. על מנת להפריד אוכלוסיות משנה ויראלי ב Vermamoeba vermiformis נגוע על ידי פאוסטווירוסים ווירוסים ענקיים לא ידוע, פיתחנו את הפרוטוקול מפורט להלן והפגינו את יכולתה להפריד בין שני שפע ווירוסים ענק הרומן.

תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

מיקרו-שאיפה של תא יחיד היא שיטה להשלמת הטכניקות השונות המשמשות בתחום המיקרוביולוגיה בכלל ובווירולוגיה בפרט. זה יכול לענות על שאלת מפתח ולפתור בעיות שנתקלו במהלך בידוד וירוסים ענקיים על ידי הפרדת וירוס מתערובת ויראלית המציגה וירוס שפע נמוך כפי שהיה במקרה של וירוסים מחזור, וירוס clandisinal, ווירוס uzibati מאחד אחר, שהוא Faustovirus, נוכח בשפע גבוה בכל מקרה. היתרון העיקרי של גישה זו הוא השימוש באסטרטגיה עקיפה.הוא מורכב מהפרדה ושיבוט של המארח הנגוע כדי להשיג הפרדה ויראלית. לכן, שיטה זו מנטרת את השלבים השונים מלכידה לשחרור תאים ומאשרת את תהליך המיון על ידי תצפית מיקרוסקופית. לבסוף, ביולוגיה מולקולרית משמשת לאישור המיון והמיקרוסקופיה האלקטרונית כדי להתבונן בחלקיקים הנגיפיים המופרדים.גישה זו תפתור את הבעיה העיקרית של הפרדת וירוסים. זה אפשרי לשיבוט ameba או שיבוט פרוטיסטים באופן כללי. האדם שמנסה להשתמש בטכניקה זו בפעם הראשונה חייב להיות קפדני ומדויק בעת שליטה בלחץ.השליטה החזותית חיונית לאישור לכידה ושחרור של תא אחד בלבד. השתמש Vermamoeba Vermiformis, זן CDC 19, כתמיכה בתא. הוסף 30 מיליליטר של מדיום PYG ושלושה מיליליטר של האמבה בריכוז של אחד 10 לתאים השישי למיליליטר בבקבוק תרבות תא 75 ס"מ מרובע.לשמור על התרבות ב 28 מעלות צלזיוס באינקובטור. לאחר 48 שעות, להעביר 10 מיליליטר של תרבות תא amoeba על שקופית ספירה ולמקום אותו תחת מיקרוסקופ לכמת את האמבה. כדי לשטוף, לקצור 30 מיליליטר של תרבות התא בצינור גלולה אמבה על ידי צנטריפוגה ב 720 פעמים G במשך 10 דקות.הסר את supernatant ו resuspend את גלולה בנפח המתאים של אמצעי רעב כדי לקבל את הריכוז של אחד פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר. הכן את התמיכה התאית עם תוספת של סוכן מיקרוביאלית. בקבינט biosafety, להוסיף פעם אחת 10 כדי השישי של תרבות אמבה לתוך שני מיליליטר של מדיום רעב.ואז לחסן 100 מיליליטר של פתרון המניות המכיל את התערובת של וירוסים לתוך התמיכה בתרבות תאים amoebae בריבוי של זיהום של 0.01. דגירה התמיכה בתרבות תאים amoebae נגוע. מוסיפים 30 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 14 שעות או עד השפעות ציטופתיות נגרמות כגון עיגול אמובל או תזה.לאחר מכן, השתמש במזרק כדי לאסוף את המדיה ולסנן באמצעות מסנן חמישה מיקרון כדי להסיר פסולת תאית. בצע דילול דגנים של המדגם הנגיפי במדיום רעב בארות שונות. לחסן שני מיליליטר של אחד פעמים 10 כדי Vermamoba Vermaformis השישי הכלול בכל צלחת פטרי עם 100 מיליליטר של inoculum תערובת.לאחר מכן, מניחים את מנות פטרי לתוך שקית ניילון אטום ב 30 מעלות צלזיוס. בשש שעות לאחר ההדבקה, התבונן בצלחות פטרי עם מיקרוסקופיה אופטית הפוכה ובדוק מורפולוגיה של התא כל ארבע עד שמונה שעות. הטיפול האנטי-מיקרוביאלי הוא לתמיכה התאית.בחר בין מנות פטרי אלה נעדרים כל זיהום חזותי על ידי סוכנים פטרייתיים חיידקיים עם ראיות של השפעה ציטופתית של אמבה עקב וירוסים עם טרום תיזה שלב עיגול של אמבה כדי למנוע שאיפה של חלקיקים ויראליים. הגדר תחנת עבודה עם מיקרו מניפולטור, התקן לחץ שליטה ידני, מיקרוסקופ הפוך, מודולי מנוע הכנס-הפעל, מצלמה ומודול מחשב. בחר נימי מיקרו של 20 מיקרון קוטר פנימי כדי לאפשר את התחזוקה של מיקום פנימי שחרור קל של התא.תקן את זווית ההפעלה של מערכת האחיזה במודול ממונע ב-45 מעלות. בצע התקנה כפולה, תחילה על מערכת האחיזה ולאחר מכן על נימי מיקרו. תתמקד בתאים.כדי לשכפל תאים, מניחים את צלחת פטרי המכילה שני מיליליטר של אמבה נגועה מתחת למיקרוסקופ. התמקדו תחילה בתאים ולאחר מכן במיקרו נימי שקוע בתרבות. לקטוף תא בודד מעוגל ולקרב את נימי המיקרו למיקרומניפולטור.להפעיל שאיפה רכה עם בקרת לחץ ידנית על התא לוקח אותו בתוך נימי מיקרו הסר את התא הבודד מן המדגם הראשון ולשחרר אותו תמיכה של תאים של amoebae. ואז לה הדגירה אותו ב30 מעלות צלזיוס. בזהירות לשלוט בלחץ כדי להיות מסוגל לשאוף תא אחד ולשלוט בשאיפה שלך על ידי התבוננות של שחרורו של תא אחד.לנהל תצפיות יומיות עם מיקרוסקופ אופטי הפוך כדי לבחון את המראה של התאים כדי לפקח על הופעתה של ההשפעה הציטופתית. עכשיו להפעיל מערכת מיצוי אוטומטית כדי לחלץ DNA מתוך חלק דגימות תרבות חיובית שבו אפקט ציטופתי הוא ציין. עיצוב פריימרים כדי להגביר גנים עניים ביאורים כמו RBP2 עבור Faustovirus, חלבון capsid העיקרי עבור Usurpatvirus, וחלבון capsid קטין עבור Clandestinovirus.בצע PCR סטנדרטי באמצעות תרמוסיקלר על פי כתב היד. לבצע 20 microliliters של תגובות PCR עם 50 micromolar של כל פריימר, 1X מאסטר מיקס, ומים חופשיים ריבונוקלאז. הפעל את מוצרי PCR עם כתם ג'ל DNA על 1.5% ג'ל אגרוז במתח של 135 וולט ולהדמיין עם UV. פרוטוקול זה ממטב תהליך מיקרו-ניהול עם שאיפה מיקרו תא יחיד.טכניקה זו מאפשרת לכידת אמבה מעוגל ונגוע ושחרורה בצלחת חדשנית המכילה אמבה לא נגועה. גישה זו בודדה בהצלחה וירוס ענק חדש בשפע נמוך בשם Userpatvirus LCD7. Userpatvirus שלך נצפתה רק שיבוט שבע עם נוכחות של ה-DNA LCD7 Userpatvirus והיעדר DNA Faustovirus.מיקרוסקופ אלקטרונים חשף את המראה של Clandestinovirus ST1, אשר יש מורפולוגיה icosahedral טיפוסי ללא fibrils, כמו גם USurpatvirus LCD7 עם קפסיד icosahedral של כ 250 ננומטר. ציטומטריה נמוכה מאשרת את החפיפה של אוכלוסיות פאוסטווירוס ונאובוירוס. לאחר השליטה, הליך זה יכול להיעשות בקלות.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא הצורך של טקס תצפיות מינימלי לגבי גודל הישויות עם טיפול טוב של מוסמך של תחנת העבודה ואת הבדיקה של כל בעיית זיהום. גישה זו יכולה לשמש כטכניקת מיון על בסיס מורפולוגיה של התא. כיום הוא משמש במעבדה שלנו לשיבוט של אמבה ספציפית.נקודה קריטית אחת בטכניקה זו היא לשמור על שלמות התא. אכן, אנחנו יכולים להיות כמה בעיות עם אי התבוננות של התא או לשחרר. הסיבה לכך היא בעיקר התפוררות התא לתוך נימי מיקרו.שיטה זו יכולה להיות חלופה יעילה כאשר טלמטריה פגומה ומיון עובדות אינם זמינים וכאשר מגיעים למגבלות טכניקה ספציפיות. אל תשכח כי במקרים מסוימים התא אינו משוחרר מן נימי מיקרו. זאת, בין השאר, בשל מאפייני אמבה ויכולתם להסתגל ולאחר מכן מממברנה התא.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג ומיון לאחר פלואורסצנטי תא פעיל עבור זיהוי, תרבות עצמאית של פחמן אורגני מומסים משפיל Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...