Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

लेखकों को उनकी सलाह और क्लेयर Andrani अंग्रेजी सुधार और संशोधनों में उसकी मदद के लिए दोनों जीन Pierre Baudoin और Olivier Mbarek धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम संदर्भ ANR-10-IAHU-03 (M]diterran-e संक्रमण के साथ "निवेश d'avenir (भविष्य के लिए निवेश)" कार्यक्रम के तहत राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी द्वारा प्रबंधित फ्रेंच राज्य से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और R$gion Provence Alpes द्वारा कोटे डी'अज़ूर और यूरोपीय वित्त पोषण FEDER PRIMI.

1. अमीबा संस्कृति
<ol><li>एक सेल समर्थन के रूप में Vermaiba वर्मीफॉर्मिस (तनाव CDC19) का प्रयोग करें.</li>
	<li>प्रोटीज़-पेपटोन-खमीर निकालने-ग्लूकोज मध्यम (पीवाईजी) (तालिका 1) और 3 एमएल अमीबा के 3एमएल को 75 सेमी2 से?...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

एकल सेल माइक्रो-आकांक्षा हैंडलिंग और इसके अच्छे कार्य की अवधि ऑपरेटर-निर्भर है। प्रयोग के विभिन्न चरणों के लिए परिशुद्धता की आवश्यकता होती है। कार्य केंद्र के micromanipulation घटकों का उपयोग सूक्ष्म आकांक्षा ?...

न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक बड़े डीएनए वायरस (NCLDV) अत्यंत विविध हैं, चार परिवारों द्वारा परिभाषित किया गया है जो यूकैरियोट1को संक्रमित करते हैं। पहले 300 केबीबीपी से ऊपर जीनोम वाले वायरस फिडकोडनविरीडीथे , जिनमें पैरामीशियम बर्सेरिया क्लोरेला वायरस 1 पीबीवीवी 12शामिल था . अलगाव और मिमीवायरस के पहले विवरण से पता चला है कि कण के आकार (450 एनएम) और जीनोम (1.2 एमबी)3दोनों के संदर्भ में वायरस का आकार दोगुना हो गया। तब से, कई विशाल वायरस वर्णित किया गया है, आमतौर पर एक अमीबा सह संस्कृति प्रक्रिया का उपयोग कर अलग. विभिन्न morphologies और आनुवंशिक सामग्री के साथ कई विशाल वायरस Acanthamoeba sp. कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है, मार्सिलेवायरस, Pandoraviruses, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus सहित, और हाल ही में मेडुसा वायरस4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. समानांतर में, Vermaba वर्मीफॉर्मिस के अलगाव और विशाल वायरस Faustovirus, Kaumoebavirus, और Orpheovirus18,19,20के विवरण की अनुमति दी. अन्य विशाल वायरस उनके मेजबान protists के साथ अलग थे, जैसे कैफेटेरिया roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina एरिकिना23, और बोडो लवण 24. इन अलगावों के सभी अलगाव पर काम कर रहे टीमों की बढ़ती संख्या का परिणाम था और उच्च थ्रूपुट रणनीति अद्यतन25,26,27,28जैसे प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग के साथ सह-संस्कृति प्रणाली में सुधार।
2016 में, हमने विशाल वायरस27को अलग करने के लिए सह-संस्कृति और प्रवाह साइटोमेट्री को संबद्ध करने वाली रणनीति का उपयोग किया। इस रणनीति को टीका लगाया नमूनों की संख्या में वृद्धि करने के लिए विकसित किया गया था, सेल का समर्थन करता है के रूप में इस्तेमाल protists विविधता लाने के लिए, और जल्दी से सेल समर्थन के lysis का पता लगाने के लिए. प्रारंभिक आण्विक जीव विज्ञान की पहचान से बचने और एक अज्ञात वायरल जनसंख्या का त्वरित पता लगाने से बचने के लिए एक पूरक कदम जोड़कर इस प्रणाली को अद्यतन किया गया था जैसा कि Pacmanvirus29के मामले में . मिमिवायरस और सेड्राटवायरस A1130के मिश्रण को अलग करने के लिए कोशिका छँटाई के लिए युग्मन प्रवाह साइटोमेट्री की अनुमति है। हालांकि, हम बाद में जुदाई और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इन वायरल subpopulations का पता लगाने की सीमाओं का सामना करना पड़ा. अनुक्रमण के बाद, जब हम Faustovirus ST125 और Faustovirus LCD7 (अप्रकाशित डेटा) के जीनोम इकट्ठा, हम आश्चर्यजनक रूप से सार्वजनिक जीनोम डेटाबेस में पहचान नहीं दो उपन्यास वायरस के दो पूरक जीनोम प्रत्येक विधानसभा में पाया. हालांकि, न तो प्रवाह साइटोमेट्री और न ही संचरण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (टीईएम) से पता चला कि अमीबा दो अलग-अलग वायरस, Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 से संक्रमित थे। हमने विशिष्ट PCR सिस्टम को उनके जीनोम के आधार पर क्रमशः Faustovirus, Usurpativirus, और Clandestinovirus मार्कर को बढ़ाना बनाया है; हमारा उद्देश्य पीसीआर आधारित सिस्टम है कि अलग किया जा रहा वायरस की शुद्धता के सत्यापन सक्षम करने के लिए किया गया था। हालांकि, अंत बिंदु कमजोर पड़ने और प्रवाह साइटोमेट्री उन्हें अलग करने में विफल रहा। इस एकल वायरल आबादी के अलगाव मुश्किल था क्योंकि न तो morphiology और न ही Clandestinovirus और Usurpativirus आबादी के प्रतिकृति तत्वों की विशेषता है. हम दो आबादी के ओवरलैपिंग के कारण प्रवाह cytometry द्वारा केवल एक वायरल आबादी का पता चला (प्रभावी जुदाई के बाद परीक्षण). हम उन्हें 96-वेल प्लेटों पर एक कण छँटाई का उपयोग कर अलग करने की कोशिश की, लेकिन हम किसी भी साइटोपैथिक प्रभाव का पालन नहीं किया, और हम पीसीआर प्रवर्धन द्वारा न तो Clandestinovirus और न ही Usurpativirus का पता चला. अंत में, यह केवल अंत बिंदु कमजोर पड़ने का संयोजन एकल अमीबा सूक्ष्म आकांक्षा है कि Faustoviruses से इन दो कम बहुतायत विशाल वायरस के जुदाई सक्षम द्वारा पीछा किया गया था. जुदाई की यह विधि इस आलेख का ऑब्जेक्ट है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

अमीबा सह-संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, एक से अधिक वायरस एक ही कुएं में अलग-थलग हो सकते हैं। हम पहले अंत बिंदु कमजोर पड़ने और / या फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) वायरल आबादी के लिए लागू द्वारा इस मुद्दे को हल किया. हालांकि, जब मिश्रण में वायरस समान morphologic गुण है और वायरस में से एक धीरे धीरे गुणा, दो वायरस की उपस्थिति जीनोम विधानसभा के चरण में की खोज की है और वायरस आगे विशेषता के लिए अलग नहीं किया जा सकता है. इस समस्या को हल करने के लिए, हम एक एकल सेल सूक्ष्म आकांक्षा प्रक्रिया है कि जुदाई और अत्यधिक इसी तरह के वायरस की क्लोनिंग के लिए अनुमति देता है विकसित की है. वर्तमान काम में, हम वर्तमान कैसे इस वैकल्पिक रणनीति हमें Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 के छोटे वायरल subpopulations अलग करने की अनुमति दी, विशाल वायरस है कि धीरे धीरे बढ़ने और lytic और तेजी से बढ़ने की तुलना में अमीबल lysis के लिए नेतृत्व नहीं करते Faustovirus. पवित्रता नियंत्रण विशिष्ट जीन प्रवर्धन द्वारा मूल्यांकन किया गया था और वायरस आगे विशेषता के लिए उत्पादन किया गया.

एकल कोशिका सूक्ष्म-आकांक्षा एक सूक्ष्म मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मैनो-मीत है। इस तकनीक से गोल, संक्रमित अमीबा (चित्र 2क) को पकड़ने में सक्ष?...

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Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

यहाँ, हम संक्रमित अमीबा के पृथक्करण के लिए एकल कोशिका सूक्ष्म-आकांक्षा विधि का वर्णन करते हैं। Faustoviruses और अज्ञात विशाल वायरस से संक्रमित Vermaiba वर्मीफॉर्मिस में वायरल subpopulations अलग करने के लिए, हम नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल विकसित की है और दो कम बहुतायत उपन्यास विशाल वायरस अलग करने की क्षमता का प्रदर्शन किया।

विशालकाय वायरस मिश्रण पृथक्करण के लिए फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में एकल सेल माइक्रो-आकांक्षा

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

एकल सेल माइक्रो-एस्पिरेशन सामान्य रूप से और विशेष रूप से वायरोलॉजी में माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में उपयोग की जाने वाली विभिन्न तकनीकों के पूरक के लिए एक विधि है। यह महत्वपूर्ण सवाल का जवाब और एक वायरल एक कम बहुतायत वायरस पेश मिश्रण से एक वायरस को अलग करके विशाल वायरस अलगाव के दौरान सामना करना पड़ा समस्याओं को हल कर सकता है के रूप में यह कारोबार वायरस, clandisinal वायरस के लिए मामला था, और एक और एक है, जो Faustovirus है, उच्च बहुतायत में वैसे भी मौजूद है से uzibati वायरस । इस दृष्टिकोण का मुख्य लाभ अप्रत्यक्ष रणनीति का उपयोग है ।यह एक वायरल जुदाई प्राप्त करने के लिए संक्रमित मेजबान को अलग करने और क्लोनिंग के होते हैं । इसलिए, यह विधि कोशिकाओं की रिहाई तक के विभिन्न चरणों पर नज़र रखता है और सूक्ष्म अवलोकन द्वारा छंटाई प्रक्रिया की पुष्टि करता है। अंत में, आणविक जीव विज्ञान का उपयोग अलग वायरल कणों का निरीक्षण करने के लिए छंटाई और इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी की पुष्टि करने के लिए किया जाता है।इस दृष्टिकोण से वायरस सेवेशन की बड़ी समस्या का समाधान होगा। यह सामान्य रूप से अमेबा या क्लोनिंग प्रोटिस्टों की क्लोनिंग के लिए एक संभावित है। जो व्यक्ति पहली बार इस तकनीक का उपयोग करने की कोशिश कर रहा है, उसे दबाव को नियंत्रित करते समय कठोर और सटीक होना चाहिए।केवल एक सेल को कैप्चर और रिलीज की पुष्टि करने के लिए दृश्य नियंत्रण आवश्यक है। वर्मामोबा वर्मीफॉर्मिस, स्ट्रेन सीडीसी 19, सेल सपोर्ट के रूप में उपयोग करें। एक ७५ वर्ग सेंटीमीटर सेल कल्चर फ्लास्क में मिलीलीटर प्रति छठी कोशिकाओं के लिए एक बार दस की एकाग्रता पर PYG माध्यम के 30 मिलीलीटर और अमीबा के तीन मिलीलीटर जोड़ें ।एक इनक्यूबेटर में 28 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बनाए रखें। 48 घंटों के बाद, अमीबा सेल संस्कृति के 10 मिलीलीटर को एक गिनती स्लाइड पर स्थानांतरित करें और अमीबा को मात्रा देने के लिए इसे माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। कुल्ला करने के लिए, एक ट्यूब में सेल संस्कृति के 30 मिलीलीटर फसल और 10 मिनट के लिए ७२० बार जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा अमीबी गोली ।सुपरनैंट निकालें और भुखमरी माध्यम की उचित मात्रा में गोली को फिर से खर्च करें ताकि प्रति मिलीलीटर छठी कोशिकाओं को एक गुना 10 की एकाग्रता प्राप्त की जा सके। एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के अलावा सेलुलर समर्थन तैयार करें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, अमीबा संस्कृति के छठे में एक बार 10 को भुखमरी माध्यम के दो मिलीलीटर में जोड़ें ।फिर 0.01 के संक्रमण की बहुलता पर अमीबा सेल कल्चर सपोर्ट में वायरस के मिश्रण वाले स्टॉक समाधान के 100 मिलीलीटर टीका लगाते हैं। संक्रमित अमीबा सेल संस्कृति समर्थन को इनक्यूबेट करें। 10 से 14 घंटे के लिए या जब तक साइटोपैथिक प्रभाव अमीबल गोलाई या लाइसिस जैसे प्रेरित नहीं होते, तब तक 30 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।इसके बाद, सेलुलर मलबे को हटाने के लिए मीडिया को इकट्ठा करने और पांच माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्ट्रेट करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। विभिन्न कुओं में भुखमरी माध्यम में वायरल नमूने का अनाज कमजोर करना करें। प्रत्येक पेट्री डिश में 100 मिलीलीटर मिश्रण इनोकुलम के साथ प्रत्येक पेट्री डिश में निहित छठे वर्मामोबा वर्माफॉर्म के लिए एक बार 10 के दो मिलीलीटर टीका।फिर, पेट्री व्यंजनों को 30 डिग्री सेल्सियस पर एक सील करने योग्य प्लास्टिक बैग में रखें। संक्रमण के बाद छह घंटे में, उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ पेट्री व्यंजन का निरीक्षण करें और हर चार से आठ घंटे में सेल आकृति विज्ञान की जांच करें। एंटी माइक्रोबियल ट्रीटमेंट सेलुलर सपोर्ट के लिए है।पेट्री व्यंजनों में फंगल और बैक्टीरियल एजेंटों द्वारा किसी भी दृश्य संदूषण के अनुपस्थित लोगों के बीच चयन करें और वायरस के कारण अमीबा के साइटोपैथिक प्रभाव के सबूत के साथ और वायरल कणों की आकांक्षा से बचने के लिए अमीबा के पूर्व-लाइसिस और गोलाई चरण के साथ। माइक्रो मैनिपुलेटर, मैनुअल कंट्रोल प्रेशर डिवाइस, उल्टे माइक्रोस्कोप, प्लग एंड प्ले मोटर मॉड्यूल, कैमरा और कंप्यूटर मॉड्यूल के साथ एक वर्क स्टेशन स्थापित करें। आंतरिक स्थिति के रखरखाव और कोशिका की आसान रिहाई की अनुमति देने के लिए 20 माइक्रोन आंतरिक व्यास का एक माइक्रो केशिका चुनें।मोटराइज्ड मॉड्यूल पर मनोरंजक प्रणाली के ऑपरेटिंग कोण को 45 डिग्री पर ठीक करें। एक डबल स्थापना प्रदर्शन, पहले मनोरंजक प्रणाली पर और फिर माइक्रो केशिका पर। कोशिकाओं पर ध्यान दें।कोशिकाओं का क्लोन बनाने के लिए, पेट्री डिश को माइक्रोस्कोप के नीचे संक्रमित अमीबा के दो मिलीलीटर रखें। पहले कोशिकाओं पर ध्यान दें और फिर संस्कृति में डूबे माइक्रो केशिका पर। गोल एकल सेल उठा और माइक्रो केशिका माइक्रोमैनीपुलेटर के करीब ले आओ।माइक्रो केशिका के अंदर ले जाने वाले सेल पर मैनुअल दबाव नियंत्रण के साथ नरम आकांक्षा डालती है पहले नमूने से एकल कोशिका को हटा दें और इसे अमीबा के सेल संस्कृति समर्थन में जारी करें। फिर इसे 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक एकल कोशिका की आकांक्षा करने और एकल कोशिका की रिहाई के अवलोकन द्वारा अपनी आकांक्षा को नियंत्रित करने में सक्षम होने के लिए दबाव को ध्यान से नियंत्रित करें।कोशिकाओं की उपस्थिति का निरीक्षण करने और साइटोपैथिक प्रभाव के उद्भव की निगरानी करने के लिए एक उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ दैनिक टिप्पणियों का संचालन करें। अब सकारात्मक संस्कृति नमूनों के हिस्से से डीएनए निकालने के लिए एक स्वचालित निष्कर्षण प्रणाली संचालित करें जहां एक साइटोपैथिक प्रभाव देखा जाता है। फॉस्टोवायरस के लिए आरबीपी 2 के रूप में एनोटेट किए गए खराब जीन, हड़पावायरस के लिए प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन और गुप्तेसिनवायरस के लिए मामूली कैप्सिड प्रोटीन को बढ़ाना के लिए प्राइमर डिजाइन करें।पांडुलिपि के अनुसार थर्मोसाइकिलर का उपयोग करके मानक पीसीआर करें। प्रत्येक प्राइमर, 1X मास्टर मिक्स, और रिबोन्यूक्लिसेज मुक्त पानी के 50 माइक्रोमॉलियर के साथ पीसीआर प्रतिक्रियाओं के 20 माइक्रोलीटर बाहर ले जाएं। 135 वोल्ट के वोल्टेज पर 1.5% एगर उठे जेल पर डीएनए जेल दाग के साथ पीसीआर उत्पादों को चलाएं और यूवी के साथ कल्पना करें। यह प्रोटोकॉल सिंगल सेल माइक्रो एस्पिरेशन के साथ माइक्रोमैनिपॉलेशन प्रोसेस को ऑप्टिमाइज़ करता है।यह तकनीक एक गोलाम और संक्रमित अमीबा को पकड़ने और असंक्रमित अमीबा युक्त उपन्यास प्लेट में इसकी रिहाई को सक्षम बनाती है। इस दृष्टिकोण ने उपयोगकर्तापटवायरस LCD7 नाम के एक नए कम बहुतायत विशाल वायरस को सफलतापूर्वक अलग कर दिया। आपका उपयोगकर्तापैटवायरस केवल क्लोन सात में उपयोगकर्तापवायरस एलसीडी7 डीएनए की उपस्थिति और फॉस्टोवायरस डीएनए की अनुपस्थिति के साथ देखा गया था।इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने गुप्त रूप से जानदार ों की उपस्थिति का खुलासा किया, जिसमें फाइब्रिल के बिना एक ठेठ icosahedral आकृति विज्ञान के साथ-साथ हड़पवायरस एलसीडी7 के साथ लगभग 250 नैनोमीटर के icosahedral कैप्सिड के साथ है। कम साइटोमेट्री फॉस्टोवायरस और नौवोरस की आबादी के ओवरलैपिंग की पुष्टि करते हैं। एक बार महारत हासिल करने के बाद, इस प्रक्रिया को आसानी से किया जा सकता है।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि कार्य स्टेशन के सक्षम की अच्छी हैंडलिंग और किसी भी संदूषण समस्या की जांच के साथ संस्थाओं के आकार से संबंधित न्यूनतम टिप्पणियों अनुष्ठान की आवश्यकता है। इस दृष्टिकोण को सेल आकृति विज्ञान के आधार पर एक छंटाई तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्तमान में यह विशिष्ट अमीबा की क्लोनिंग के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है।इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण बिंदु सेल अखंडता को बनाए रखना है। दरअसल, हम सेल या रिहाई के गैर अवलोकन के साथ कुछ समस्या हो सकती है । यह ज्यादातर सूक्ष्म केशिका में कोशिका के विघटन के कारण होता है।यह विधि एक कुशल विकल्प हो सकती है जब दोष टेलीमेट्री और तथ्य छंटाई उपलब्ध नहीं होती है और जब विशिष्ट तकनीक सीमाएं पहुंच जाती हैं। यह न भूलें कि कुछ मामलों में सेल को माइक्रो केशिका से जारी नहीं किया जाता है। यह अमीबा विशेषताओं और अनुकूलन के लिए उनकी क्षमता और फिर कोशिका झिल्ली से भाग में कारण है।

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

प्रतिदीप्ति सक्रिय संयंत्र Protoplasts के सेल छंटनी

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) लेबल और बाद प्रतिदीप्ति संस्कृति - स्वतंत्र भंग कार्बनिक की पहचान के लिए सक्रिय सेल छंटनी कार्बन अपमानजनक Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

डीएनए टुकड़े के पृथक्करण के लिए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

सेल के विशिष्ट विश्लेषण<em&gt; Arabidopsis</em&gt; प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग पत्ते

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

सेल डिवीजन ट्रैकिंग सेल रंजक का उपयोग करने की निगरानी के लिए अनुकूलित धुंधला और प्रसार मॉडलिंग तरीकों

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

ताजा ऊतकों से सामान्य और कैंसर से जुड़े fibroblasts की प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा अलगाव

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

सेल संचार विश्लेषण के लिए एकल कोशिका Microinjection

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

संवेदनशील, बड़े पैमाने पर मात्रात्मक Metabolomics के लिए एक रणनीति

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

कम सेल मंदिर विश्लेषण के लिए संख्या के साथ नमूना तैयार करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

स्लेरेक्टिनियन सेल आबादी के अलगाव के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...