Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare sia Jean-Pierre Baudoin che Olivier Mbarek per i loro consigli e Claire Andréani per il suo aiuto nelle correzioni e nelle modifiche inglesi. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dello Stato francese gestita dall'Agenzia nazionale di ricerca nell'ambito del programma "Investissements d'avenir (Investments for the Future)" con il riferimento ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée Infection) e dal Région Provence Alpes Costa Azzurra e finanziamento europeo FEDER PRIMI.

1. Cultura di Amoeba
<ol><li>Utilizzare Vermamoeba vermiformis (strain CDC19) come supporto cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 30 mL di proteasi-peptone-lievito medio di estratto-glucosio (PYG) (Tabella 1) e 3 mL di amebe ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL in un fiascheta di coltura cellulare 75 cm2.</li>
	<li>Mantenere la coltura a 28 gradi centigradi.</li>
	<li>Dopo 48 h, quantificare le amebe utilizzando vetrine di conteggio.</li>
	<li>Per sciacquare, raccogliere...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

La durata della gestione della microaspirazione a cella singola e il suo buon funzionamento dipendono dall'operatore. Le diverse fasi dell'esperimento richiedono precisione. L'uso dei componenti di micromanipolazione della postazione di lavoro deve essere sotto costante controllo osservando il processo di microaspirazione e il rilascio della cellula. Il follow-up per osservazione microscopica è necessario per la cattura e il trasferimento di una cellula. Un operatore esperto può prendere da 1 a 2 h per isolare 10 cellu...

I virus del DNA di grandi dimensioni nucleocitoplasmatici (NCLDV) sono estremamente diversi, definiti da quattro famiglie che infettano gli eucarioti1. I primi virus descritti con genomi superiori a 300 kbp sono stati Phydcodnaviridae, tra cui il virus paramecium bursaria Chlorella 1 PBCV12. L'isolamento e la prima descrizione di Mimivirus, ha mostrato che la dimensione dei virus è raddoppiata sia in termini di dimensioni della particella (450 nm) che di lunghezza del genoma (1,2 Mb)3. Da allora, sono stati descritti molti virus giganti, di solito isolati utilizzando una procedura di co-coltura ameba. Diversi virus giganti con diverse morfologie e contenuti genetici possono essere isolati dalle cellule di Acanthamoeba sp., tra cui Marseillevirus, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, e recentemente Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallelamente, l'isolamento di Vermamoeba vermiformis ha permesso l'isolamento e la descrizione dei virus giganti Faustovirus, Kaumoebavirus e Orpheovirus18,19,20. Altri virus giganti sono stati isolati con i loro protisti ospiti, come Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, e Bodo saltans 24. Tutti questi isolati sono il risultato di un numero crescente di team che lavorano sull'isolamento e dell'introduzione di aggiornamenti della strategia ad alta velocità effettiva25,26,27,28, come il miglioramento del sistema di cocoltura con l'uso della citometria di flusso.
Nel 2016 abbiamo utilizzato una strategia che associa la cocultura e la citometria di flusso per isolare i virus giganti27. Questa strategia è stata sviluppata per aumentare il numero di campioni inoculati, per diversificare i protisti usati come supporti cellulari e per rilevare rapidamente la lisi del supporto cellulare. Il sistema è stato aggiornato aggiungendo un passo supplementare per evitare l'identificazione preliminare della biologia molecolare e la rapida individuazione di una popolazione virale sconosciuta come nel caso del Pacmanvirus29. La citometria del flusso di accoppiamento allo smistamento cellulare ha permesso la separazione di una miscela di Mimivirus e Cedratvirus A1130. Tuttavia, in seguito abbiamo incontrato i limiti della separazione e del rilevamento di queste sottopopolazioni virali per citometria di flusso. Dopo il sequenziamento, quando abbiamo assemblato i genomi di Faustovirus ST125 e Faustovirus LCD7 (dati inediti), abbiamo sorprendentemente trovato in ogni assemblaggio due genomi supplementari di due nuovi virus non identificati nei database pubblici del genoma. Tuttavia, né la citometria di flusso né la microscopia elettronica di trasmissione (TEM) hanno mostrato che le amebe sono state infettate da due virus diversi, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7. Abbiamo progettato sistemi PCR specifici per amplificare i marcatori Faustovirus, Usurpativirus e Clandestinovirus rispettivamente in base ai loro genomi; il nostro scopo era quello di avere sistemi pcR-based che consentono la verifica della purezza dei virus separati. Tuttavia, la diluizione dell'estremità puntino e la citometria di flusso non sono riusciti a separarli. L'isolamento di questa singola popolazione virale è stato difficile perché non sono stati caratterizzati né la morfologia né gli elementi replicativi delle popolazioni di Clandestino virus e Usurpativirus. Abbiamo rilevato una sola popolazione virale per citometria di flusso a causa della sovrapposizione delle due popolazioni (testata dopo l'effettiva separazione). Abbiamo cercato di separarli usando lo smistamento di singole particelle su piastre di 96 pozzi, ma non abbiamo osservato alcun effetto citopatico, e abbiamo rilevato né Il Clandestinovirus né l'Usurpativirus dall'amplificazione PCR. Infine, è stata solo la combinazione di diluizione del punto finale seguita da una singola micro-aspirazione di ameba che ha permesso la separazione di questi due virus giganti a bassa abbondanza dai Faustovirus. Questo metodo di separazione è l'oggetto di questo articolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

Durante il processo di co-coltura dell'ameba, più di un virus può essere isolato in un unico pozzo. In precedenza abbiamo risolto questo problema per diluizione all'estremità e/o la fluorescenza, applicato alla popolazione virale per la diluizione e/o la fluorescenza. Tuttavia, quando i virus nella miscela hanno proprietà morfologiche simili e uno dei virus si moltiplica lentamente, la presenza di due virus viene scoperta nello stadio di assemblaggio del genoma e i virus non possono essere separati per un'ulteriore caratterizzazione. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una procedura di microaspirazione a singola cellula che consente la separazione e la clonazione di virus altamente simili. Nel presente lavoro, presentiamo come questa strategia alternativa ci ha permesso di separare le piccole sottopopolazioni virali del Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, virus giganti che crescono lentamente e non portano a lisi ameaka rispetto alla litetica e in rapida crescita Faustovirus. Il controllo della purezza è stato valutato da specifici virus e amplificazione genica per un'ulteriore caratterizzazione.

La micro-aspirazione a cella singola è un processo di micromanipolazione ottimizzato in questo manoscritto (Figura 1). Questa tecnica consente l'acquisizione di un'ameba arrotondata e infettata (Figura 2A) e la sua uscita in una nuova lastra contenente amebe non infette (Figura 2). Si tratta di un prototipo funzionale che si applica al sistema di co-cultura e ha isolato con successo virus giganti non litici. Questo...

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Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Qui, descriviamo un metodo di microaspirazione a singola cellula per la separazione delle amebe infette. Al fine di separare le sottopopolazioni virali in Vermamoeba vermiformis infettate da Faustovirus e virus giganti sconosciuti, abbiamo sviluppato il protocollo descritto di seguito e dimostrato la sua capacità di separare due nuovi virus giganti a bassa abbondanza.

Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

La micro-aspirazione a cella singola è un metodo per integrare le diverse tecniche utilizzate nel campo della microbiologia in generale e in virologia in particolare. Potrebbe rispondere alla domanda chiave e risolvere i problemi incontrati durante l'isolamento dei virus giganti separando un virus da una miscela virale che presenta un virus a bassa abbondanza come nel caso di virus turnover, virus clandisinale e virus uzibati da un altro, che è Faustovirus, presente comunque in alta abbondanza. Il principale vantaggio di questo approccio è l'uso di una strategia indiretta.Consiste nel separare e clonare l'ospite infetto per ottenere una separazione virale. Quindi, questo metodo monitora i diversi passaggi dall'acquisizione al rilascio delle cellule e conferma il processo di ordinamento mediante osservazione microscopica. Infine, la biologia molecolare viene utilizzata per confermare lo smistamento e la microscopia elettronica per osservare le particelle virali separate.Questo approccio risolverà il principale problema della separazione dei virus. Si tratta di una prospettiva di clonazione ameba o di clonazione di protisti in generale. La persona che sta cercando di utilizzare questa tecnica per la prima volta deve essere rigorosa e precisa quando controlla la pressione.Il controllo visivo è essenziale per confermare l'acquisizione e il rilascio di una sola cella. Utilizzare Vermamoeba Vermiformis, ceppo CDC 19, come supporto cellulare. Aggiungere 30 millilitri di mezzo PYG e tre millilitri dell'ameba a una concentrazione di una per dieci alla sesta cella per millilitro in un pallone da coltura cellulare di 75 centimetri quadrati.Mantenere la coltura a 28 gradi Celsius in un incubatore. Dopo 48 ore, trasferire 10 millilitri della coltura cellulare dell'ameba su uno scivolo di conteggio e posizionarlo al microscopio per quantificare le amebe. Per risciacquare, raccogliere 30 millilitri della coltura cellulare in un tubo e pelletare l'amebae per centrifugazione a 720 volte G per 10 minuti.Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet nel volume appropriato del mezzo di fame per ottenere la concentrazione di una volta 10 alla sesta cellule per millilitro. Preparare il supporto cellulare con l'aggiunta di agente antimicrobico. In un armadio di biosicurezza, aggiungere uno per 10 al sesto della coltura di ameba in due millilitri di mezzo di fame.Quindi inoculare 100 millilitri della soluzione stock contenente la miscela di virus nel supporto di coltura cellulare delle amebe a una molteplicità di infezione di 0,01. Incubare il supporto per la coltura delle cellule amebe infette. Aggiungere 30 gradi Celsius per 10-14 ore o fino a quando non vengono indotti effetti citopatici come arrotondamento amebale olisi.Quindi, utilizzare una siringa per raccogliere il supporto e filtrare attraverso un filtro da cinque micron per rimuovere i detriti cellulari. Eseguire una diluizione dei cereali del campione virale nel mezzo di fame in diversi pozzi. Inoculare due millilitri da uno per 10 al sesto Vermamoba Vermaformis contenuto in ogni piastra di Petri con 100 millilitri della miscela inoculo.Quindi, posizionare le piastre di Petri in un sacchetto di plastica sigillabile a 30 gradi Celsius. A sei ore dall'infezione, osservare le piastre di Petri con microscopia ottica invertita e controllare la morfologia cellulare ogni quattro o otto ore. Il trattamento antimicrobico è per il supporto cellulare.Selezionare tra le piastre di Petri quelle assenti da qualsiasi contaminazione visiva da agenti fungini e batterici e con evidenza di effetto citopatico delle amebe dovute ai virus e con prelisi e fase di arrotondamento delle amebe per evitare l'aspirazione di particelle virali. Impostare una stazione di lavoro con micro manipolatore, dispositivo di pressione di controllo manuale, microscopio invertito, moduli Plug and Play Motor, fotocamera e modulo computer. Scegli un micro capillare di 20 micron di diametro interno per consentire la manutenzione di una posizione interna e un facile rilascio della cella.Fissare l'angolo di funzionamento del sistema di presa sul modulo motorizzato a 45 gradi. Eseguire una doppia installazione, prima sul sistema di presa e poi sul micro capillare. Concentrati sulle celle.Per clonare le cellule, posizionare la piastra di Petri contenente due millilitri di amebe infette al microscopio. Concentrati prima sulle cellule e poi sul micro capillare immerso nella coltura. Raccogliere una singola cella arrotondata e avvicinare il micro capillare al micromanipolatore.Esercitare un'aspirazione morbida con controllo manuale della pressione sulla cella prendendola all'interno del micro capillare Rimuovere la singola cella dal primo campione e rilasciarla nel supporto di coltura cellulare dell'amebae. Quindi incubarlo a 30 gradi Celsius. Controlla attentamente la pressione per poter aspirare una singola cellula e controllare la tua aspirazione mediante l'osservazione del rilascio di una singola cellula.Condurre osservazioni giornaliere con un microscopio ottico invertito per osservare l'aspetto delle cellule e monitorare l'emergere dell'effetto citopatico. Ora aziona un sistema di estrazione automatizzato per estrarre il DNA da parte dei campioni di coltura positiva in cui si osserva un effetto citopatico. Primer di progettazione per amplificare i geni poveri annotati come RBP2 per Faustovirus, proteina capsid principale per usurpatvirus e proteina capsid minore per il Clandestinovirus.Eseguire pcr standard utilizzando un termociclometro secondo il manoscritto. Effettuare 20 microlitri di reazioni PCR con 50 micromolari di ogni primer, 1X Master Mix e acqua priva di ribonucleasi. Eseguire i prodotti PCR con macchia di gel DNA su un gel di agarosio all'1,5% alla tensione di 135 volt e visualizzare con UV. Questo protocollo ottimizza un processo di micromanipolazione con micro aspirazione a cella singola.Questa tecnica consente la cattura di un'ameba arrotondata e infetta e il suo rilascio in una nuova lastra contenente amebe non infette. Questo approccio ha isolato con successo un nuovo virus gigante a bassa abbondanza chiamato Userpatvirus LCD7. Il tuo Userpatvirus è stato osservato solo nel clone sette con presenza di DNA LCD7 userpatvirus e assenza di DNA Faustovirus.La microscopia elettronica ha rivelato l'aspetto del Clandestinovirus ST1, che ha una tipica morfologia icosaedrale senza fibrille così come l'Usurpatvirus LCD7 con un capsid icosaedro di circa 250 nanometri. La bassa citometria conferma la sovrapposizione delle popolazioni di Faustovirus e Nauvoirus. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita facilmente.La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è la necessità di un rituale minimo di osservazioni riguardanti le dimensioni degli enti con la buona gestione della competente del posto di lavoro e il controllo di eventuali problemi di contaminazione. Questo approccio può essere utilizzato come tecnica di smistamento sulla base della morfologia cellulare. Attualmente viene utilizzato nel nostro laboratorio per la clonazione di ameba specifica.Un punto critico di questa tecnica è mantenere l'integrità della cella. In effetti, possiamo avere alcuni problemi con la mancata osservazione della cellula o il rilascio. Ciò è dovuto principalmente alla disintegrazione della cellula nel micro capillare.Questo metodo potrebbe essere un'alternativa efficiente quando la telemetria dei difetti e l'ordinamento dei fatti non sono disponibili e quando vengono raggiunte specifiche limitazioni tecniche. Non dimenticare che in alcuni casi la cellula non viene rilasciata dal micro capillare. Ciò è dovuto in parte alle caratteristiche delle amebe e alla loro capacità di adattamento e quindi dalla membrana cellulare.

Research

JoVE Journal

Biology

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Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

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Biologia

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