Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

著者たちは、ジャン=ピエール・ボードゥアンとオリヴィエ・ムバレクのアドバイスとクレア・アンドレアニの英語の修正と修正に関する彼女の助けに感謝したいと思います。この作品は、ANR-10-IAHU-03(メディテラネ感染症)とレジオン・プロヴァンス・アルプを参照する「投資・ダベニール(未来への投資)」プログラムの下で、国家研究機関が管理するフランス国家からの助成金によって支援されました。コートダジュールとヨーロッパの資金調達フェデラープリミ。

1. アメーバ文化
<ol><li>細胞サポートとしてベルマメーバ・バーミフォルミス(株CDC19)を使用してください。</li>
	<li>プロテアーゼ-ペプトン-酵母エキスグルコース培地(PYG)(表1)とアメーバの3mLを75cm2細胞培養フラスコに1x10 6細胞/mLの濃度で加えます。</li>
	<li>培養を28°Cに保つ。</li>
	<li>48時間後、カウントスライドを用いてアメーバを定量する。</li>
	<li>すす?...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

単一細胞マイクロ吸引処理の持続時間および良好な機能はオペレータに依存する。実験の異なるステップは、精度を必要とします。ワークステーションのマイクロ操作コンポーネントの使用は、マイクロ吸引のプロセスと細胞の放出を観察することによって一定の制御下になければなりません。顕微鏡観察によるフォローアップは、細胞の捕獲と移動に必要です。経験豊富なオペレータは、1...

核細胞質大DNAウイルス(NCLDV)は、真核生物1に感染する4つのファミリーによって定義される非常に多様である。300kbpを超えるゲノムを有する最初の記載のウイルスはフィコドナウイルス科、パラメシウムブルサリアクロレラウイルス1 PBCV12を含む。MimiVirusの単離および最初の説明は、ウイルスの大きさが粒子の大きさ(450nm)とゲノムの長さ(1.2Mb)3の両方の点で倍増することを示した。それ以来、多くの巨大ウイルスが記載されており、通常はアメーバ共培養手順を用いて単離される。異なる形態と遺伝的内容を持ついくつかの巨大なウイルスは、マルセイユウイルス、パンドラウイルス、ピトウイルス、モリウイルス、セドラットウイルス、パックマンウイルス、トゥパンウイルス、および最近を含むアカントアメーバ球細胞から単離することができるメデューサウイルス4,5,6,7,8,9,10,11,12,13、14、15、16、17.並行して、ベルマモエバ・バーミフォルミスの単離により、ファウストウイルス、カウモエバウイルス、およびオルフェオウイルス18、19、20の巨大ウイルスの単離および説明が可能となった。他の巨大ウイルスは、カフェテリア・レンゲンシス21、アウレオコッカス・アノファゲフェレンス22、クリソクロムリナ・エリチナ23、ボド・サルタンなどの宿主プロティストと共に単離された。 24.これらの分離はすべて、分離に取り組むチームの数が増え、高スループット戦略の更新が導入された結果です。フローサイトメトリーを用いる共培養システムの改善
2016年には、共培養とフローサイトメトリーを関連付ける戦略を用いて巨大ウイルス27を単離しました。この戦略は、接種するサンプルの数を増やし、細胞支持体として使用されるプロティストを多様化し、細胞支持体の上昇を迅速に検出するために開発されました。システムは、Pacmanvirus29の場合のように、予備的な分子生物学の同定と未知のウイルス集団の迅速な検出を避けるために補足ステップを追加することによって更新された。細胞選別への結合フローサイトメトリーは、ミミウイルスとセドラトウイルスA1130の混合物の分離を可能にする。しかし、後にフローサイトメトリーによるこれらのウイルス亜集団の分離と検出の限界に遭遇しました。シーケンシング後、ファウストウイルスST125とファウストウイルスLCD7(未発表データ)のゲノムを組み立てたとき、公共ゲノムデータベースで同定されていない2つの新規ウイルスの2つの補足ゲノムを各アセンブリで驚くほど見つけました。しかし、フローサイトメトリーも透過電子顕微鏡(TEM)も、アメーバが2つの異なるウイルス、クランデスチノウイルスST1およびウスルパティウイルスLCD7によって感染していることを示さなかった。我々は、ファウストウイルス、ウスルパティウイルス、クランデスチノウイルスマーカーをそれぞれゲノムに基づいて増幅する特定のPCRシステムを設計した。私たちの目的は、分離されているウイルスの純度の検証を可能にするPCRベースのシステムを持つことです。しかし、終点希釈とフローサイトメトリーはそれらを分離できませんでした。クランデスチノウイルスおよびウスルパティウイルス集団の形態および複製要素のいずれも特徴付けされていないため、この単一のウイルス集団の分離は困難であった。2つの集団の重複(有効分離後に試験)により、フローサイトメトリーによってウイルス集団を1つだけ検出した。96ウェルプレート上で単一粒子選別を行って分離しようとしましたが、細胞障害効果は観測されず、PCR増幅によってクランデスチノウイルスもウスルパティウイルスも検出しませんでした。最後に、エンドポイント希釈の組み合わせのみに続いて、ファウストウイルスからこれら2つの低存在量の巨大ウイルスの分離を可能にした単一のアメーバマイクロ吸引の組み合わせだけでした。この分離方法は、この資料の対象です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

アメーバ共培養プロセス中に、複数のウイルスを単一のウェルで単離してもよい。我々は以前、ウイルス集団に適用される終点希釈および/または蛍光活性化細胞選別(FACS)によってこの問題を解決した。しかし、混合物中のウイルスが類似した形態学的特性を有し、ウイルスの1つがゆっくりと増殖すると、ゲノムアセンブリの段階で2つのウイルスの存在が発見され、ウイルスはそれ以上の特徴付けのために分離することができない。この問題を解決するために、類似性の高いウイルスの分離とクローニングを可能にする単一細胞マイクロ吸引手順を開発しました。本研究では、この代替戦略により、クランデスチノウイルスST1とウスルパティウイルスLCD7の小さなウイルス亜集団を分離し、ゆっくりと成長し、溶解性および急速に成長するアメーバル溶解に至らない巨大ウイルスをどのように分離することができたかを提示する。ファウストウイルス。純度制御は、特異的遺伝子増幅によって評価され、ウイルスはさらに特徴付けのために産生された。

単一細胞マイクロ吸引は、この原稿で最適化されたマイクロマニピュレーションプロセスです(図1)。この技術により、丸みを帯びた感染アメーバ(図2A)の捕捉と、未感染アメーバを含む新規プレートでの放出が可能になります(図2)。これは、共培養システムに適用され、正常に非溶解性巨大ウイルスを隔離した機?...

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Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

ここでは、感染アメーバの分離のための単一細胞マイクロ吸引法について説明する。ファウストウイルスと未知の巨大ウイルスに感染したヴェルマメーバ・バーミフォルミスのウイルス亜集団を分離するために、以下に詳述するプロトコルを開発し、2つの低存在量の新規巨大ウイルスを分離する能力を実証した。

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

単一細胞微小吸引は、微生物学全般、特にウイルス学の分野で使用される異なる技術を補完する方法である。これは、重要な質問に答え、巨大なウイルスの分離中に遭遇した問題を解決することができ、ターンオーバーウイルス、クランジジンウイルス、およびファウストウイルスである別のものからウジバチウイルスの場合のように、低量のウイルスを提示するウイルス混合物からウイルスを分離し、とにかく高い量に存在する。このアプローチの主な利点は、間接戦略の使用です。感染した宿主を分離してクローニングしてウイルス分離を得る。そこで、この方法は、細胞の捕獲から放出までの異なるステップを監視し、顕微鏡観察による選別プロセスを確認します。最後に、分子生物学は、分離されたウイルス粒子を観察するために選別および電子顕微鏡を確認するために使用される。このアプローチは、ウイルス分離の主要な問題を解決します。これは、一般的にアメバのクローニングやクローニングプロティストのための将来です。この技術を初めて使用しようとする人は、圧力を制御する際に厳密かつ正確でなければなりません。この視覚制御は、1 つのセルのキャプチャとリリースを確認するために不可欠です。セル支持体として、フェルマメーババーミフォルミ、ひずみCDC 19を使用する。75平方センチメートルの細胞培養フラスコに1ミリリットル当たり10倍から6番目の細胞の濃度でPYG培地30ミリリットルとアメーバの3ミリリットルを加える。インキュベーターで28°Cの文化を維持します。48時間後、アメーバ細胞培養液の10ミリリットルを計数スライドに移し、顕微鏡下に置いてアメーバを定量化する。すすべるために、30ミリリットルの細胞培養物をチューブに収穫し、10分間Gの720倍で遠心分離によりアメーバをペレットにする。上清を取り除き、適切な量の飢餓培地中のペレットを再懸濁し、1ミリリットル当たり6番目の細胞に10倍の濃度を得る。抗菌剤を添加して細胞サポートを準備する。バイオセーフティキャビネットでは、アメーバ培養の6回目に10倍から6分の1を2ミリリットルの飢餓培地に加えます。次に、ウイルスの混合物を含むストック溶液を0.01の感染の多重度でアメーバ細胞培養支持体に接種する。感染したアメーバ細胞培養サポートをインキュベートする。10〜14時間、またはアメーバル丸めやリシスなどの細胞パシー効果が誘発されるまで、摂氏30度を加えます。次に、注射器を使用して培地を収集し、5ミクロンのフィルターを通して濾過して細胞の破片を除去する。異なるウェルで飢餓培地中のウイルスサンプルの穀物希釈を行う。各ペトリ皿に含まれる第6のヴェルマモバ・ヴェルマフォルミスに10倍の2ミリリットルを接種し、100ミリリットルの混合物を接種する。その後、ペトリ料理を30°Cの密封可能なビニール袋に入れます。感染後6時間で、逆光顕微鏡でペトリ皿を観察し、4〜8時間ごとに細胞形態をチェックする。抗菌処理は細胞のサポートのための。ペトリ皿の中から、真菌および細菌剤による視覚汚染の存在しないもの、およびウイルスによるアメーバの細胞パシー効果の証拠と、ウイルス粒子の吸引を避けるためにアメーバの前リシスおよび丸め段階を有するものを選択する。マイクロマニピュレータ、手動制御圧力装置、反転顕微鏡、プラグアンドプレイモーターモジュール、カメラ、コンピュータモジュールを備えたワークステーションを設置します。内部位置の維持と細胞の容易な放出を可能にするために20ミクロンの内径のマイクロキャピラリーを選びましょう。電動モジュールのグリップシステムの動作角度を45度で固定します。最初にグリップシステムで、次にマイクロキャピラリーで、二重インストールを実行します。細胞に焦点を当てます。細胞をクローン化するには、感染したアメーバの2ミリリットルを含むペトリ皿を顕微鏡の下に置く。まず細胞に焦点を当て、次に培養に浸したマイクロ毛細血管に焦点を当てます。丸みを帯びた単一細胞を選び、マイクロキャピラリーをマイクロマニピュレーターに近づける。マイクロキャピラリーの内側に取る細胞に手動で圧力制御を加えて柔らかい吸引を行い、最初のサンプルから単一の細胞を取り出し、アメーバの細胞培養サポートで放出します。その後、摂氏30度でインキュベートします。慎重に単一の細胞を熱望し、単一の細胞の放出の観察によってあなたの抱負を制御することができるように圧力を制御する。反転した光学顕微鏡で毎日観察を行い、細胞の外観を観察し、細胞変性効果の出現を監視します。現在、細胞性効果が観察される陽性培養サンプルの一部からDNAを抽出するために、自動抽出システムを操作します。ファウストウイルスのRBP2、ウスパトウイルスの主要なキャプシドタンパク質、およびクランデスチノウイルスのマイナーキャプシドタンパク質として標識された貧しい遺伝子を増幅するプライマーを設計する。原稿に従ってサーモサイクラーを使用して標準PCRを行います。各プライマー、1Xマスターミックス、およびリボヌクレアーゼフリー水の50マイクロモルでPCR反応の20マイクロリリライタを実施します。1.5%のアガロースゲルの電圧135ボルトでDNAゲル染色でPCR製品を実行し、UVで可視化します。このプロトコルは単一細胞マイクロ吸引でマイクロマニピュレーションプロセスを最適化する。この技術は、丸みを帯びて感染したアメーバの捕獲と、感染していないアメーバを含む新規プレートでの放出を可能にする。このアプローチは、Userpatvirus LCD7という新しい低存在量の巨大ウイルスを正常に分離しました。お客様のユーザーパトウイルスは、Userpatvirus LCD7 DNAの存在とファウストウイルスDNAの存在を持つクローン7でのみ観察されました。電子顕微鏡は、フィブリルのない典型的な異端体形態を有するクランデスチノウイルスST1の出現と、約250ナノメートルの二面体キャプシドを有するウスルパトウイルスLCD7の出現を明らかにした。低細胞測定は、ファウストウイルスとノーボイラスの集団の重複を確認する。マスター化すれば、この手順は簡単に行うことができます。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、作業ステーションの有能な取り扱いと汚染の問題のチェックを持つエンティティのサイズに関する最小限の観察の儀式の必要性です。このアプローチは、細胞形態に基づくソート技法として使用することができる。現在、それは特定のアメーバのクローニングのために私たちの研究室で使用されています.この手法の重要なポイントの 1 つは、セルの整合性を維持することです。実際、細胞の非観察や放出に問題が生じる可能性があります。これは、主に細胞がマイクロ毛細血管に崩壊するためである。この方法は、欠陥テレメトリとファクトの並べ替えが利用できない場合や、特定の手法の制限に達した場合に、効率的な代替手段となる可能性があります。場合によっては、細胞がマイクロ毛細血管から放出されないことを忘れないでください。これは、アメーバの特性と、細胞膜から適応し、その後の能力の一部によるものです。

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

ブロモデオキシウリジン（BrdU）標識と溶存有機の文化に依存しない識別に対する後続の蛍光活性化細胞選別カーボン分解Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

DNA断片の分離のためのアガロースゲル電気泳動

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

セル通信解析のための単一細胞のマイクロインジェクション

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

TEM分析のための低細胞数とサンプル調製のための代替的アプローチ

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...