Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

저자들은 장 피에르 바우도인과 올리비에 음바렉에게 조언을 해준 장 피에르 바우도인과 클레어 안드레아니에게 영어 수정과 수정에 도움을 준 것에 대해 감사를 표하고 싶다. 이 작품은 참조 ANR-10-IAHU-03 (메디테라네 감염) 및 레지온 프로방스 알프스에 의해 "투자 d'avenir (미래를위한 투자)"프로그램에 따라 국립 연구 기관에 의해 관리 프랑스 국가에서 보조금에 의해 지원되었다 코트 다쥐르와 유럽 자금 조달 페더 프리미.

1. 아메바 문화
<ol><li>Vermamoeba vermiformis (균주 CDC19)를 세포 지원으로 사용하십시오.</li>
	<li>프로테아제-펩톤-효모 추출물-글루코스 배지(PYG)(표1)와아메바의 3 mL를 75 cm2 세포 배양 플라스크에 1 x 10 6 세포/mL의 농도로 첨가한다.</li>
	<li>28°C에서 배양을 유지한다.</li>
	<li>48 시간 후, 계산 슬라이드를 사용하여 아메배를 정량화.</li>
	<li>헹구려면 세포를 1 x 106</su...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

단일 셀 마이크로 흡인 처리의 지속 시간과 그 양호한 기능은 연산자 의존적입니다. 실험의 다른 단계에는 정밀도가 필요합니다. 워크스테이션의 미세 조작 성분의 사용은 마이크로 흡인 의 과정과 세포의 방출을 관찰하여 일정한 제어를 받아야합니다. 현미경 관찰에 의한 후속 조치는 세포의 포획 및 전달에 필요합니다. 숙련된 작업자는 10개의 세포를 분리하고 격리할 바이러스의 풍부에 따라 ?...

핵세포질 대형 DNA 바이러스 (NCLDV)는 진핵생물1을감염시키는 4개의 가족에 의해 정의된 극단적으로 다양합니다. 300 kbp 이상의 게놈을 가진 제1기 바이러스는 파라메치움 부르사리아 클로렐라 바이러스 1 PBCV12를포함하는 Phydcodnaviridae이었다. Mimivirus의 격리 및 첫 번째 설명은, 입자의 크기(450 nm)와 게놈(1.2 Mb)의 길이 모두에서 바이러스의 크기가 두 배로 증가한다는 것을 보여주었다3. 그 이후로, 많은 거대한 바이러스는 아메바 공동 배양 절차를 사용하여 일반적으로 격리, 설명되었다. 상이한 형태와 유전적 내용을 가진 몇몇 거대한 바이러스는 마르세유바이러스, 판도라바이러스, 피토바이러스, 몰리바이러스, 세드라트바이러스, 팩만바이러스, 투판바이러스, 및 최근 을 포함하는 세포로부터 분리될 수 있다. 메두사 바이러스4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. 이와 병행하여, Vermamoeba vermiformis의 격리는 파우스토바이러스, 카우모에바바이러스 및 오르페오바이러스18,19,20의분리 및 설명을 허용했다. 다른 거대 바이러스는 카페테리아 로엔텐시스21, 아우레오코커스 아노파페렌스22, 크리소크로물리나 에리시나23,보도 살탄과 같은 호스트 프로티스트와 함께 분리되었다. 24. 이러한 모든 격리는 격리 작업 팀의 증가와 높은 처리량 전략 업데이트의 도입의 결과였다25,26,27,28, 유세포분석의 사용과 함께 공동 배양 시스템의 개선.
2016년에는 거대 바이러스27을분리하기 위해 공동 배양 및 유세포 분석과 연계전략을 사용했습니다. 이 전략은 접종된 샘플의 수를 늘리고, 세포 지원으로 사용되는 프로티스트를 다양화하고, 세포 지지체의 용해를 신속하게 검출하기 위해 개발되었습니다. 이 시스템은 Pacmanvirus29의경우와 같이 예비 분자 생물학 식별 및 알 수없는 바이러스 집단의 빠른 검출을 피하기 위한 추가 단계를 추가하여 업데이트되었습니다. 미미바이러스와 세드라트바이러스 A1130의혼합물을 분리할 수 있도록 세포 선별에 유동 세포분석. 그러나, 우리는 나중에 유세포측정에 의한 이러한 바이러스 성 하위 집단의 분리 및 검출의 한계를 만났다. 시퀀싱 후, 우리는 Faustovirus ST125 및 Faustovirus LCD7 (미공개 데이터)의 게놈을 조립할 때, 우리는 놀랍게도 공공 게놈 데이터베이스에서 확인되지 않은 두 개의 새로운 바이러스의 두 개의 보충 게놈을 각 어셈블리에서 발견했습니다. 그러나, 유동 세포분석이나 투과 전자 현미경 검사법(TEM)은 아메바에가 두 가지 다른 바이러스인 클렌데스티노바이러스 ST1 및 우스르파티바이러스 LCD7에 감염된 것으로 나타났다. 우리는 그들의 게놈에 근거를 둔 파우스토바이러스, 우스르파티바이러스 및 클라데스티노바이러스 마커를 각각 증폭하기 위하여 특정 PCR 시스템을 설계했습니다; 우리의 목적은 분리되는 바이러스의 순도의 검증을 가능하게 하는 PCR 기반 시스템을 가지고 있었습니다. 그러나, 종점 희석 및 유세포세포는 이를 분리하지 못했다. 이 단 하나 바이러스성 인구의 고립은 Clandestinovirus와 Usurpativirus 인구의 형태 또는 복제 요소도 특징적이지 않았기 때문에 어려웠습니다. 우리는 두 집단의 중첩으로 인해 유동 세포측정에 의해 하나의 바이러스 집단을 검출했습니다 (효과적인 분리 후에 테스트). 우리는 96 웰 플레이트에 단일 입자 선별을 사용하여 그들을 분리하려고했지만, 우리는 어떤 세포 병증 효과를 관찰하지 않았다, 우리는 CLANDESTinovirus도 PCR 증폭에 의해 Usurpativirus를 감지하지 않았다. 마지막으로, 파우스토바이러스로부터 이 두 개의 저급한 거대 바이러스를 분리할 수 있게 한 것은 단 하나의 아메바 마이크로 포부에 이어 종점 희석의 조합일 뿐이었다. 이 분리 방법은 이 문서의 대상입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

아메바 공동 배양 과정 동안, 하나 이상의 바이러스가 단일 웰에서 단리될 수 있다. 우리는 이전에 바이러스 집단에 적용된 종점 희석 및/또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 이 문제를 해결했습니다. 그러나 혼합물의 바이러스가 유사한 형태학적 특성을 가지고 있고 바이러스 중 하나가 천천히 증식하면 게놈 조립 단계에서 두 바이러스의 존재가 발견되고 바이러스가 추가 특성화를 위해 분리 될 수 없습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 매우 유사한 바이러스의 분리 및 복제를 허용하는 단일 세포 마이크로 흡인 절차를 개발했습니다. 본 작품에서, 우리는 이 대체 전략이 어떻게 우리가 Clandestinovirus ST1와 Usurpativirus LCD7의 작은 바이러스성 소집단을 분리하는 것을 허용하는지, 천천히 성장하고 용해 및 급속하게 성장하는 것에 비해 아메발 용해로 이끌어 내지 않는 거대한 바이러스를 제시합니다 파우스토바이러스. 순도 대조군은 특정 유전자 증폭에 의해 평가되었고 바이러스는 추가적인 특성화를 위해 생산되었다.

단세포 마이크로 흡인은 이 원고에 최적화된 미세 조작 과정이다(도1). 이 기술은 둥근, 감염된 아메바(그림 2A)의포획을 가능하게하고 감염되지 않은 아메바(그림 2)를포함하는 새로운 판에서 방출한다. 그것은 공동 문화 시스템에 적용 하 고 성공적으로 비 lytic 거 대 한 바이러스를 격리 하는 기능 프로토 타입. 이 접...

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Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

여기서, 우리는 감염된 아메바의 분리를 위한 단일 세포 마이크로 흡인 방법을 기술한다. 파우스토바이러스와 알려지지 않은 거대 바이러스에 감염된 Vermamoeba vermiformis의 바이러스 하위 집단을 분리하기 위해, 우리는 아래에 자세히 설명된 프로토콜을 개발하고 두 개의 저풍부 신규 거대 바이러스를 분리하는 능력을 입증했습니다.

거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

단세포 마이크로 포부는 미생물학 분야에서 일반적으로 그리고 특히 바이러스학에서 사용되는 상이한 기술을 보완하는 방법입니다. 그것은 주요 질문에 대답 하 고 바이러스 를 제시 하는 바이러스 혼합물에서 바이러스를 분리 하 여 발생 하는 문제를 해결할 수 있습니다 낮은 풍부한 바이러스를 제시 하는 바이러스 바이러스, 은밀한 바이러스, 그리고 다른 하나에서 uzibati 바이러스, 파우스토 바이러스는 어쨌든 높은 풍부에 존재. 이 방법의 주요 장점은 간접 전략의 사용입니다.감염된 숙스를 분리하고 복제하여 바이러스 분리를 얻는 것으로 구성됩니다. 따라서 이 방법은 포획에서 세포 방출까지의 다양한 단계를 모니터링하고 현미경 관찰에 의한 선별 과정을 확인합니다. 마지막으로, 분자 생물학은 분리된 바이러스 입자를 관찰하기 위해 선별 및 전자 현미경 검사를 확인하는 데 사용된다.이 방법은 바이러스 분리의 주요 문제를 해결할 것입니다. 그것은 일반적으로 아메바를 복제하거나 프로테스트를 복제하기위한 예비입니다. 처음으로이 기술을 사용 하려고하는 사람은 압력을 제어 할 때 엄격하고 정확해야합니다.시각적 제어는 하나의 셀의 캡처 및 방출을 확인하는 데 필수적입니다. 베르마모에바 베르미포르미스, 변형 CDC 19를 세포 지지체로 사용하십시오. 75 평방 센티미터 세포 배양 플라스크에서 밀리리터 당 여섯 번째 세포에 10 배의 농도에 PYG 배지의 30 밀리리터와 아메바의 3 밀리리터를 추가합니다.인큐베이터에서 섭씨 28도에서 문화를 유지하십시오. 48시간 후, 아메바 세포 배양10밀리리터를 카운팅 슬라이드로 옮기고 현미경으로 배치하여 아메배를 정량화한다. 헹구려면, 튜브에서 세포 배양의 30 밀리리터를 수확하고 10분 동안 720회 G에서 원심분리로 아메배를 펠릿한다.상체를 제거하고 밀리리터당 1회 10분의 1의 농도를 얻기 위해 기아 배지의 적절한 부피에서 펠릿을 재연한다. 항균제의 첨가로 세포 지원을 준비한다. 생물 안전 캐비닛에서 아메바 문화의 여섯 번째에 10번을 기아 배지 2밀리리터에 넣습니다.이어서 0.01의 다형성에서 아메배 세포 배양 지원에 바이러스의 혼합물을 함유한 스톡 용액100밀리리터를 접종한다. 감염된 아메배 세포 배양 지원을 배양한다. 10~14시간 동안 섭씨 30도를 추가하거나 아메발 반올림 또는 용해와 같은 세포병증 효과가 유발될 때까지 추가하십시오.다음으로 주사기를 사용하여 미디어를 수집하고 5미크론 필터를 통해 여과하여 셀룰러 이물질을 제거합니다. 다른 우물에서 기아 배지에서 바이러스 성 샘플의 시리얼 희석을 수행합니다. 혼합물 접종의 100 밀리리터와 각 페트리 접시에 포함 된 여섯 번째 베르마모바 베르마 포르미에 1 회 10 의 2 밀리리터를 접종.그런 다음 페트리 요리를 밀봉 가능한 비닐 봉지에 섭씨 30도에 넣습니다. 감염 후 6시간 에서, 반전된 광학 현미경으로 페트리 접시를 관찰하고 4~8시간마다 세포 형태를 확인하십시오. 항균 치료는 세포 지원을 위한 것입니다.페트리 접시 중에서 곰팡이와 세균성 제제에 의한 시각적 오염이 없는 것과 바이러스로 인한 아모에배의 세포병증 효과의 증거와 바이러스 입자의 포부를 피하기 위해 아메배의 사전 용해 및 반올림 단계의 증거를 선택하십시오. 마이크로 조작기, 수동 제어 압력 장치, 반전 된 현미경, 플러그 앤 플레이 모터 모듈, 카메라 및 컴퓨터 모듈로 워크 스테이션을 설정합니다. 내부 위치의 유지 및 세포의 쉬운 방출을 허용하기 위해 20 미크로인 내부 직경의 마이크로 모세관을 선택합니다.전동 모듈의 그립 시스템의 작동 각도를 45도로 수정합니다. 먼저 그립 시스템에 두 번 설치한 다음 마이크로 모세관에 설치합니다. 셀에 집중합니다.세포를 복제하려면 감염된 아메배 2밀리리터를 함유한 페트리 접시를 현미경 으로 놓습니다. 먼저 세포에 초점을 맞춘 다음 배양에 침지된 마이크로 모세관에 집중하십시오. 둥근 단세포를 따기와 마이크로 조작기에 가까운 마이크로 모세관을 가져옵니다.마이크로 모세관 내부를 복용하는 세포에 수동 압력 조절을 사용하여 부드러운 포부를 발휘하여 첫 번째 샘플에서 단일 세포를 제거하고 아메배의 세포 배양 지원에 방출한다. 그런 다음 섭씨 30도에서 배양하십시오. 단일 셀을 갈망하고 단일 셀의 방출을 관찰하여 포부를 제어 할 수있는 압력을 신중하게 제어할 수 있습니다.세포의 출현을 관찰하고 세포 병증 효과의 출현을 모니터링하기 위해 반전 된 광학 현미경으로 매일 관찰을 수행합니다. 이제 세포병증 효과가 관찰되는 양성 배양 샘플의 일부에서 DNA를 추출하기 위해 자동화된 추출 시스템을 운영하고 있습니다. 파우스토바이러스의 RBP2로 부음된 가난한 유전자, 우수르트바이러스의 주요 캡시드 단백질, 클랜데스티노바이러스의 경미한 캡시드 단백질을 증폭시키는 프라이머를 설계한다.원고에 따라 써모사이클러를 사용하여 표준 PCR을 수행합니다. 각 프라이머의 50 마이크로몰라, 1X 마스터 믹스 및 리보누프리 워터의 50 마이크로릴리터20마이크로릴리터를 수행합니다. 135볼트의 전압에서 DNA 젤 얼룩으로 PCR 제품을 1.5% 아가로즈 젤에 바르고 UV로 시각화합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 마이크로 포부로 미세 조작 프로세스를 최적화합니다.이 기술은 둥글고 감염된 아메바와 감염되지 않은 아메배를 포함하는 새로운 판에서 방출을 포착할 수 있게 한다. 이 방법은 Userpatvirus LCD7이라는 이름의 새로운 저풍 거대 바이러스를 성공적으로 격리했습니다. Userpatvirus는 Userpatvirus LCD7 DNA의 존재와 파우스토 바이러스 DNA의 부재와 클론 7에서만 관찰되었다.전자 현미경 검사법은 약 250 나노미터의 icosahedral 캡시드와 유혈구없이 전형적인 icosahedral 형태뿐만 아니라 Usurpatvirus LCD7을 가지고 Clandestinovirus ST1의 모양을 밝혔다. 낮은 세포질은 파우스토바이러스와 나부리우스의 인구가 겹치는 것을 확인합니다. 일단 마스터되면이 절차를 쉽게 수행 할 수 있습니다.이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 워크 스테이션의 유능한 처리와 오염 문제의 확인을 가진 개체의 크기에 관한 최소한의 관찰 의식의 필요성입니다. 이 방법은 세포 형태에 기초하여 선별 기술로 사용될 수 있습니다. 현재 그것은 특정 아메바의 복제에 대 한 우리의 실험실에서 사용 됩니다.이 기술의 한 가지 중요한 점은 세포 무결성을 유지하는 것입니다. 실제로, 우리는 세포 또는 방출의 비 관찰에 몇 가지 문제가있을 수 있습니다. 이것은 주로 마이크로 모세관으로 세포의 붕괴 때문입니다.이 방법은 결함 원격 분석 및 팩트 정렬을 사용할 수 없는 경우와 특정 기술 제한에 도달할 때 효율적인 대안이 될 수 있습니다. 어떤 경우에는 세포가 마이크로 모세관에서 방출되지 않는다는 것을 잊지 마십시오. 이것은 아메배 특성과 세포막에서 적응하는 그들의 능력에 부분적으로 기인합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

연구

생물학

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

의 DNA 조각의 분리를위한 아가로 오스 젤 전기 영동

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...