Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke både Jean-Pierre Baudoin og Olivier Mbarek for deres råd og Claire Andréani for hennes hjelp på engelsk rettelser og modifikasjoner. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra den franske staten forvaltes av National Research Agency under "Investissements d'avenir (investeringer for fremtiden)" program med referanse ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée infeksjon) og ved Région Provence Alpes Côte d'Azur og europeisk finansiering FEDER PRIMI.

1. Amoeba kultur
<ol><li>Bruk Vermamoeba vermiformis (stamme CDC19) som en celle støtte.</li>
	<li>Tilsett 30 mL protease-peptone-gjærekstrakt-glukose medium (PYG) (tabell 1) og 3 ml av amøber ved en konsentrasjon på 1 x 106 celler/ml i en 75 cm2 cellekultur kolbe.</li>
	<li>Oppretthold kulturen ved 28 ° c.</li>
	<li>Etter 48 h, kvantifisere amøber ved hjelp av telling lysbilder.</li>
	<li>For å skylle, høste cellene ved en konsentrasjon på 1 x 106 cel...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

Varigheten av enkelt celle mikro-aspirasjon håndtering og god funksjon er operatøravhengig. De ulike trinnene i eksperimentet krever presisjon. Bruken av de mikromanipulering komponentene i arbeidsstasjonen må være under konstant kontroll ved å observere prosessen med mikro-aspirasjon og utgivelsen av cellen. Oppfølgingen av mikroskopisk observasjon er nødvendig for fangst og overføring av en celle. En erfaren operatør kan ta 1 til 2 t for å isolere 10 celler og skrivermodeller dem en etter en, avhengig av over...

Nucleocytoplasmic store DNA virus (NCLDV) er svært mangfoldig, definert av fire familier som infisere Landplantenes1. Det for det første beskrevet viruser med genomer over 300 KBP var Phydcodnaviridae, inkluderer amøbehjerne bursaria chlorella virus 1 PBCV12. Isolasjonen og den første beskrivelsen av Mimivirus, viste at størrelsen på viruset doblet i forhold til både størrelsen på partikkel (450 nm) og lengden på Genova (1,2 MB)3. Siden da har mange gigantiske virus blitt beskrevet, vanligvis isolert ved hjelp av en Amoeba co-kultur prosedyre. Adskillige giganten viruser med annerledes morfologier og genetisk innholdet kan isolere fra Acanthamoeba Sp. celler, inkluderer Marseilleviruses, Pandoraviruses, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus, og i den seneste tid Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallelt var isolasjonen av Vermamoeba vermiformis tillatt isolasjonen og beskrivelsen av de gigantiske virusene Faustovirus, Kaumoebavirus og Orpheovirus18,19,20. Andre gigantiske virus ble isolert med verts protister, som kafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23og Bodø saltans 24. Alle disse isolasjoner var resultatet av et økende antall lag som jobbet med isolasjon og innføringen av strategi oppdateringer med høy gjennomstrømming25,26,27,28, slik som forbedring av co-kulturen systemet med bruk av Flow flowcytometri.
I 2016, vi brukte en strategi knytte co-kultur og flyt flowcytometri å isolere gigantiske virus27. Denne strategien ble utviklet for å øke antall prøver inokulert, å diversifisere protister brukt som celle støtter, og for raskt å oppdage lyse av cellen støtte. Systemet ble oppdatert ved å legge til et supplerende skritt for å unngå foreløpige molekylærbiologi identifisering og rask påvisning av en ukjent viral befolkning som i tilfelle av Pacmanvirus29. Koblings flyt flowcytometri til celle sortering som er tillatt ved separasjon av en blanding av Mimivirus og Cedratvirus A1130. Men vi senere møtte begrensningene av separasjon og påvisning av disse viral subpopulasjoner ved flyt flowcytometri. Etter sekvensering, når vi samlet genomer av Faustovirus ST125 og Faustovirus LCD7 (upubliserte data), vi overraskende funnet i hver forsamling to supplerende genomer av to romanen virus ikke identifisert i offentlige Genova databaser. Imidlertid viste verken flyt flowcytometri eller overføring av elektroniske mikroskopi (TEM) at amoebaes ble infisert av to forskjellige virus, Clandestinovirus ST1 og Usurpativirus LCD7. Vi utformet spesifikke PCR-systemer for å forsterke Faustovirus, Usurpativirus, og Clandestinovirus markører henholdsvis basert på deres genomer; vårt formål var å ha PCR-baserte systemer som muliggjør verifisering av renheten av virusene blir separert. Imidlertid klarte ikke ende punkts fortynning og strømnings flowcytometri å skille dem. Isolasjonen av denne ene viral befolkningen var vanskelig fordi verken morfologi eller replicative elementer av Clandestinovirus og Usurpativirus befolkninger har blitt karakterisert. Vi oppdaget bare en viral befolkning av flyte flowcytometri på grunn av det overlappe av det to befolkninger (testet etter det effektiv atskillelse). Vi prøvde å skille dem ved hjelp av én partikkel sortering på 96-brønn plater, men vi observerte ingen Cytopathic effekter, og vi oppdaget verken Clandestinovirus eller Usurpativirus av PCR-forsterkning. Til slutt var det bare kombinasjonen av endepunktet fortynning etterfulgt av singel Amoeba mikro-aspirasjon som aktiverte separasjon av disse to lav-overflod gigantiske virus fra Faustoviruses. Denne metoden for separasjon er gjenstand for denne artikkelen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

Under Amoeba co-kultur prosessen, mer enn ett virus kan være isolert i en enkelt brønn. Vi har tidligere løst dette problemet ved sluttpunkt fortynning og/eller fluorescens aktivert celle sortering (FACS) brukes til viral befolkningen. Men når virus i blandingen har lignende morfologiske egenskaper og en av virusene multipliserer langsomt, er tilstedeværelsen av to virus oppdaget på scenen av Genova montering og virus kan ikke skilles for videre karakterisering. For å løse dette problemet, utviklet vi en enkelt celle mikro-aspirasjon prosedyre som gjør det mulig for separasjon og kloning av svært like virus. I dagens arbeid, presenterer vi hvordan denne alternative strategien tillot oss å skille de små viral subpopulasjoner av Clandestinovirus ST1 og Usurpativirus LCD7, gigantiske virus som vokser langsomt og ikke fører til amoebal lyse i forhold til lytisk og raskt voksende Faustovirus. Renhet kontroll ble vurdert av spesifikke gen forsterkning og virus ble produsert for videre karakterisering.

Enkelt celle mikro-aspirasjon er en mikromanipulering prosess optimalisert i dette manuskriptet (figur 1). Denne teknikken gjør det mulig å fange opp en avrundet, infisert Amoeba (figur 2a) og dens utgivelse i en roman plate som inneholder infisert amøber (figur 2). Det er en funksjonell prototype som gjelder for co-kulturen systemet og har lykkes isolert ikke-lytisk gigantiske virus. Denne tilnærmingen ble bruk...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Her beskriver vi en enkelt celle mikro-aspirasjon metode for separasjon av infiserte amøber. For å skille viral subpopulasjoner i Vermamoeba vermiformis smittet av Faustoviruses og ukjente gigantiske virus, utviklet vi protokollen detaljert nedenfor og demonstrerte sin evne til å skille to lav-overflod romanen gigantiske virus.

Single Cell Micro-aspirasjon som en alternativ strategi for å fluorescens-aktivert Cell sortering for Giant virus blanding separasjon

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Single Cell Micro-Aspirasjon er en metode for å utfylle de ulike teknikkene som brukes innen mikrobiologi generelt og i virologi spesielt. Det kan svare på viktige spørsmål og løse problemer som oppstår under gigantisk virusisolasjon ved å skille et virus fra en viral blanding presentere en lav overflod Virus som det var tilfelle for omsetning virus, clandisinal virus, og uzibati virus fra en annen, som er Faustovirus, til stede i høy overflod likevel. Den største fordelen med denne tilnærmingen er bruken av en indirekte strategi.Den består av å skille og klone den infiserte verten for å oppnå en viral separasjon. Så denne metoden overvåker de forskjellige trinnene fra fangst til frigjøring av celler og bekrefter sorteringsprosessen ved mikroskopisk observasjon. Til slutt brukes molekylærbiologi til å bekrefte sortering og elektronisk mikroskopi for å observere de separerte viruspartiklene.Denne tilnærmingen vil løse det store problemet med virusseparasjon. Det er en prospektiv for kloning ameba eller kloning protists generelt. Personen som prøver å bruke denne teknikken for første gang må være streng og presis når du kontrollerer trykket.Den visuelle kontrollen er viktig for å bekrefte fangsten og utgivelsen av bare én celle. Bruk Vermamoeba Vermiformis, stamme CDC 19, som en cellestøtte. Tilsett 30 milliliter PYG medium og tre milliliter av amøbe i en konsentrasjon på en gang ti til de sjette cellene per milliliter i en 75 kvadratcentimeter cellekulturkolbe.Opprettholde kulturen på 28 grader Celsius i en inkubator. Etter 48 timer, overfør 10 milliliter av amøbecellekulturen på et tellelysbilde og legg den under et mikroskop for å kvantifisere amøbe. For å skylle, høst 30 milliliter av cellekulturen i et rør og pellet amoebae ved sentrifugering ved 720 ganger G i 10 minutter.Fjern den overnaturlige og resuspend pellet i riktig volum av sult medium for å oppnå konsentrasjonen av en ganger 10 til de sjette cellene per milliliter. Forbered cellulær støtte med tilsetning av antimikrobiell middel. I et biosikkerhetsskap, legg til en ganger 10 til den sjette av amøbekulturen i to milliliter sultmedium.Deretter inokulerer 100 milliliter av lagerløsningen som inneholder blandingen av virus i amøbecellekulturstøtten ved et mangfold av infeksjon på 0,01. Inkuber den infiserte amøbecellekulturstøtten. Tilsett 30 grader Celsius i 10 til 14 timer eller til cytopatiske effekter er indusert som amoebal avrunding eller lysis.Deretter bruker du en sprøyte til å samle opp media og filtrat gjennom et fem mikronfilter for å fjerne cellulært avfall. Utfør en kornfortynning av virusprøven i sultemediet i forskjellige brønner. Inokuler to milliliter av en ganger 10 til den sjette Vermamoba Vermaformis inneholdt i hver petriskål med 100 milliliter av blandingen inoculum.Deretter plasserer petriskålene i en forseglet plastpose ved 30 grader Celsius. På seks timer etter infeksjon, observere Petri retter med invertert optisk mikroskopi og sjekk celle morfologi hver fjerde til åtte timer. Den antimikrobielle behandlingen er for cellulær støtte.Velg blant Petri retter de som er fraværende av visuell forurensning av sopp og bakterielle midler og med tegn på cytopatisk effekt av amøbe på grunn av virusene og med pre-lysis og avrundingsfase av amøbe for å unngå aspirasjon av viruspartikler. Konfigurer en arbeidsstasjon med mikromanipulator, manuell kontrolltrykkenhet, invertert mikroskop, Plug and Play Motor-moduler, kamera og datamodul. Velg en mikrokapillær på 20 mikron indre diameter for å tillate vedlikehold av en intern posisjon og en enkel frigjøring av cellen.Fest driftsvinkelen til gripesystemet på den motoriserte modulen ved 45 grader. Utfør en dobbel installasjon, først på gripesystemet og deretter på mikrokapillæren. Fokuser på cellene.For å klone celler, legg petriskålen som inneholder to milliliter infisert amøbe under mikroskopet. Fokuser først på cellene og deretter på mikrokapillæren nedsenket i kulturen. Plukking avrundet enkeltcelle og bringe mikrokapillæren nærmere mikromanipulatoren.Utøve myk aspirasjon med manuell trykkkontroll på cellen tar den inne i mikrokapillæren Fjern enkeltcellen fra den første prøven og slipp den i amøbeas cellekulturstøtte. Deretter inkubere den ved 30 grader Celsius. Kontroller trykket forsiktig for å kunne strebe etter en enkelt celle og kontrollere aspirasjonen din ved observasjon av frigjøring av en enkelt celle.Utuk daglige observasjoner med et omvendt optisk mikroskop for å observere cellenes utseende og for å overvåke fremveksten av den cytopatiske effekten. Nå opererer et automatisert ekstraksjonssystem for å trekke ut DNA fra en del av de positive kulturprøvene der en cytopatisk effekt observeres. Design primere for å forsterke dårlige gener kommentert som RBP2 for Faustovirus, store capsid protein for Usurpatvirus, og mindre capsid protein for Clandestinovirus.Utfør standard PCR ved hjelp av en termocycler i henhold til manuskriptet. Utfør 20 mikroliter PCR-reaksjoner med 50 mikromos av hver primer, 1X Master Mix og ribonuclease fritt vann. Kjør PCR-produktene med DNA gel flekk på en 1,5% agarose gel i spenningen på 135 volt og visualisere med UV. Denne protokollen optimaliserer en mikromanimuleringsprosess med encellede mikroaspirasjon.Denne teknikken gjør det mulig å fange en avrundet og infisert amøbe og utgivelsen i en ny plate som inneholder uinfisert amøbe. Denne tilnærmingen vellykket isolert en ny lav overflod gigantisk virus kalt Userpatvirus LCD7. Ditt Userpatvirus ble bare observert hos klone syv med tilstedeværelse av Userpatvirus LCD7 DNA og fravær av Faustovirus DNA.Elektronmikroskopi avslørte utseendet til Clandestinovirus ST1, som har en typisk icosahedral morfologi uten fibriller samt Usurpatvirus LCD7 med en icosahedral capsid på ca 250 nanometer. Lav cytometri bekrefter overlappingen av populasjoner av Faustovirus og Nauvoirus. Når mestret, kan denne prosedyren gjøres enkelt.Det viktigste å huske når du prøver denne prosedyren er nødvendigheten av et minimum observasjoner ritual om størrelsen på enhetene med god håndtering av den kompetente av arbeidsstasjonen og kontroll av eventuelle forurensning problem. Denne tilnærmingen kan brukes som en sorteringsteknikk på grunnlag av cellemorfologi. For tiden brukes det i vårt laboratorium for kloning av spesifikk amøbe.Et kritisk punkt i denne teknikken er å opprettholde celleintegriteten. Faktisk kan vi ha noen problemer med ikke-observasjon av cellen eller utgivelsen. Dette skyldes for det meste oppløsningen av cellen i mikrokapillæren.Denne metoden kan være et effektivt alternativ når feil telemetri og fakta sortering ikke er tilgjengelig, og når bestemte teknikk begrensninger er nådd. Ikke glem at cellen i noen tilfeller ikke frigjøres fra mikrokapillæren. Dette skyldes delvis amøbeegenskapene og deres evne til å tilpasse seg og deretter fra cellemembranen.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gelelektroforese for separasjon av DNA-fragmenter

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell konkret analyse av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Leaves med fluorescens Aktivert Cell Sortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolering av Normal og kreft-assosiert fibroblaster fra Fresh vev ved Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Encellede Mikroinjeksjon for Cell Communication analyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi for Sensitive, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

En alternativ tilnærming for prøveopparbeidelse med lav celle nummer for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Fluorescensaktivert cellesortering for isolering av sklerractiniske cellepopulasjoner

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...