Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить как Jean-Pierre Baudoin, так и Оливье Мбарек за их советы и Клэр Андреани за ее помощь в коррекции и модификации английского языка. Эта работа была поддержана грантом от французского государства, управляемым Национальным исследовательским агентством в рамках программы «Инвестиции в будущее» с помощью anR-10-IAHU-03 (Инфекция Медитерране) и Региона Провансальских Альп Лазурный берег и европейское финансирование FEDER PRIMI.

1. Культура Амебы
<ol><li>Используйте Vermamoeba vermiformis (напряжение CDC19) в качестве поддержки клеток.</li>
	<li>Добавьте 30 мл протеазы-пептон-дрожжи экстракт-глюкоза среднего (PYG)(Таблица 1) и 3 мл амеба в концентрации 1 х 106 клеток / мл в 75 см2 колбы культуры клеток.</li>
	<li>Поддержи...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

Продолжительность обработки микроаспирации одной ячейки и ее хорошее функционирование зависят от оператора. Различные этапы эксперимента требуют точности. Использование микроманипуляций компонентов рабочей станции должно находиться под постоянным контролем, наблюдая за процессом...

Нуклеоцитоплазмамические крупные ДНК-вирусы (NCLDV) чрезвычайно разнообразны, определяемые четырьмя семьями, которые заражают эукариоты1. Первые описанные вирусы с геномами выше 300 кбит/с были Phydcodnaviridae, в том числе Paramecium бурсария хлореллы вирус 1 PBCV12. Изоляция и первое описание Мимивируса, показали, что размер вирусов удвоился как с точки зрения размера частицы (450 нм) и длины генома (1,2 Мб)3. С тех пор многие гигантские вирусы были описаны, как правило, изолированы с помощью амебы совместной культуры процедуры. Несколько гигантских вирусов с различными морфологиями и генетическим содержанием могут быть выделены из клеток Acanthamoeba sp., включая Марсельскиевирусы, Пандоравирусы, Питховирусы, Молливирус, Седратвирусы, Pacmanvirus, Tupanvirus, и в последнее время Медузавирус4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Параллельно изоляция Vermamoeba vermiformis позволила изоляции и описания гигантских вирусов Faustovirus, Kaumoebavirus, и Орфеовирус18,19,20. Другие гигантские вирусы были изолированы с их принимающей протеистов, таких как кафетерий roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, и Бодо saltans 24. Все эти изоляции были результатом увеличения числа групп, работающих над изоляцией и введением обновлений стратегии высокой пропускной связи25,26,27,28,таких как улучшение системы совместной культуры с использованием цитометрии потока.
В 2016 году мы использовали стратегию, связывающую кокультуру и цитометрию потока, чтобы изолировать гигантские вирусы27. Эта стратегия была разработана для увеличения количества образцов, чтобы диверсифицировать протистов, используемых в качестве клеточных опор, и быстро обнаружить лиза клеточной поддержки. Система была обновлена путем добавления дополнительного шага, чтобы избежать предварительной молекулярной биологии идентификации и быстрого обнаружения неизвестной вирусной популяции, как в случае Pacmanvirus29. Соединение цитометрии потока к сортировке клеток позволило разделить смесь мимивируса и седратвируса А1130. Однако позже мы столкнулись с ограничениями разделения и обнаружения этих вирусных субпопуляций цитометрией потока. После секвенирования, когда мы собрали геномы Faustovirus ST125 и Faustovirus LCD7 (неопубликованные данные), мы удивительно обнаружили в каждой сборке два дополнительных генома двух новых вирусов, не идентифицированных в базах данных общественного генома. Однако ни цитометрия потока, ни электронная микроскопия передачи (ТЭМ) не показали, что амебы были заражены двумя различными вирусами: Clandestinovirus ST1 и Usurpativirus LCD7. Мы разработали специальные ПЦР-системы для усиления маркеров Фаустовируса, Усурпативируса и кландедестовируса соответственно на основе их геномов; нашей целью было наличие систем на основе ПЦР, которые позволяют проверить чистоту разделенных вирусов. Однако, конечная точка разбавления и потока цитометрии не удалось разделить их. Изоляция этой единственной вирусной популяции была трудной, поскольку ни морфология, ни репликационные элементы популяций кландестовируса и узурпативируса не были охарактеризованы. Мы обнаружили только одну вирусную популяцию цитометрией потока из-за перекрытия двух популяций (проверено после эффективного разделения). Мы пытались разделить их с помощью сортировки одной частицы на 96-колодцах пластинах, но не наблюдали никаких цитопатических эффектов, и мы не обнаружили ни кландестовируса, ни усурпативируса при усилении ПЦР. Наконец, только сочетание разбавления конечной точки, за которым последовало микроапиратное амеба, позволило отделить эти два гигантских вируса с низким изобилием от фаустовирусов. Этот метод разделения является объектом этой статьи.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

Во время процесса кокультуры амебы, более одного вируса могут быть изолированы в одном колодце. Ранее мы решили эту проблему путем разбавления конечных точек и/или флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS), применяемой к вирусной популяции. Однако, когда вирусы в смеси имеют схожие морфологические свойства и один из вирусов размножается медленно, наличие двух вирусов обнаруживается на стадии сборки генома и вирусы не могут быть разделены для дальнейшей характеристики. Чтобы решить эту проблему, мы разработали процедуру микроаспирации, которая позволяет отделять и клонировать очень похожие вирусы. В настоящей работе мы представляем, как эта альтернативная стратегия позволила нам отделить небольшие вирусные субпопуляции clandestinovirus ST1 и Usurpativirus LCD7, гигантские вирусы, которые растут медленно и не приводят к амебальному лисису по сравнению с литиком и быстрорастущим Фаустовирус. Контроль чистоты оценивался по специфическим усиливанию генов, и для дальнейшей характеристики были созданы вирусы.

Одноклеточная микроаспирация — это процесс микроманипуляции, оптимизированный в данной рукописи(рисунок 1). Этот метод позволяет захватить округлые, инфицированные амебы(Рисунок 2)и его выпуск в новой пластине, содержащей неинфицированных аме...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Здесь мы описываем метод микроаспирации одной клетки для разделения инфицированных амеб. Для того, чтобы отделить вирусные субпопуляции в Vermamoeba vermiformis, инфицированных faustoviruses и неизвестных гигантских вирусов, мы разработали протокол подробно ниже и продемонстрировали его способность отделить два низкого изобилия новых гигантских вирусов.

Одноклеточная микро-аспирация в качестве альтернативной стратегии для флуоресценции активированной сортировки клеток для гигантского разделения вирусной смеси

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Одноклеточный микро-аспирации является методом в дополнение к различным методам, используемым в области микробиологии в целом и в вирусологии в частности. Он мог бы ответить на ключевой вопрос и решить проблемы, с которыми сталкиваются во время изоляции гигантских вирусов, отделяя вирус от вирусной смеси, представляя низкий уровень изобилия Вирус, как это было в случае оборота вирусов, кланового вируса, и uzibati вирус от другого, который является Фаустовирус, присутствует в высоком изобилии в любом случае. Основным преимуществом такого подхода является использование косвенной стратегии.Она состоит из разделения и клонирования инфицированного хозяина для получения вирусного разделения. Таким образом, этот метод отслеживает различные шаги от захвата до высвобождения клеток и подтверждает процесс сортировки микроскопическим наблюдением. Наконец, молекулярная биология используется для подтверждения сортировки и электронной микроскопии для наблюдения за разделенными вирусными частицами.Такой подход позволит решить основную проблему разделения вирусов. Это перспектива для клонирования амебы или клонирования протистов в целом. Человек, который пытается использовать эту технику в первый раз должны быть строгими и точными при контроле давления.Визуальный контроль необходим для подтверждения захвата и выпуска только одной ячейки. Используйте Vermamoeba Vermiformis, штамм CDC 19, в качестве поддержки клеток. Добавьте 30 миллилитров среды PYG и три миллилитров амебы при концентрации один раз десять- до шестой клетки на миллилитр в колбе культуры 75 квадратных сантиметров.Поддерживайте культуру на уровне 28 градусов по Цельсию в инкубаторе. После 48 часов, передача 10 миллилитров амебы клеточной культуры на счет слайда и поместить его под микроскопом для количественной оценки амебы. Чтобы промыть, урожай 30 миллилитров клеточной культуры в трубке и гранулы амебы центрифугации при 720 раз G в течение 10 минут.Удалить супернатант и повторно гранулы в соответствующем объеме голодания среды для получения концентрации один раз 10 до шестой клетки на миллилитр. Подготовье клеточной поддержки с добавлением противомикробного препарата. В кабинете биобезопасности, добавить один раз 10 к шестой амебы культуры в два миллилитров голода среды.Затем привить 100 миллилитров фондового раствора, содержащего смесь вирусов в амебной клеточной культуры поддержки при множественности инфекции 0,01. Инкубировать инфицированных амебных клеток поддержки культуры. Добавить 30 градусов по Цельсию в течение 10 до 14 часов или до тех пор, пока цитопатические эффекты индуцируются, такие как амебал округливания или лиза.Затем используйте шприц для сбора мультимедиа и фильтрации через фильтр из пяти микрон для удаления клеточного мусора. Выполните разбавление зерновых вирусного образца в голодании среды в различных скважинах. Прививают два миллилитров по одному разу от 10 до шестого Vermamoba Vermaformis, содержащихся в каждой чашке Петри со 100 миллилитров смеси inoculum.Затем поместите посуду Петри в герметичным полиэтиленовым пакетом при 30 градусах по Цельсию. В шесть часов после заражения наблюдайте за блюдами Петри с перевернутой оптической микроскопией и проверяйте морфологию клеток каждые четыре-восемь часов. Антимикробное лечение для клеточной поддержки.Выберите среди чашек Петри те, отсутствует каких-либо визуальных загрязнений грибковых и бактериальных агентов и с доказательствами цитопатический эффект амеб из-за вирусов и с предварительной лиза и округление фазы амеб, чтобы избежать аспирации вирусных частиц. Настройка рабочей станции с микро-манипулятором, устройством ручного управления давлением, перевернутым микроскопом, модулями Plug и Play Motor, камерой и компьютерным модулем. Выберите микро капилляр диаметром 20 микрон, чтобы обеспечить содержание внутреннего положения и легкое высвобождение клетки.Зафиксирование угла работы системы захвата на моторизованном модуле при 45 градусах. Выполните двойную установку, сначала на системе захвата, а затем на микро капилляре. Сосредоточьтесь на клетках.Чтобы клонировать клетки, поместите чашку Петри, содержащую два миллилитров инфицированных амеб под микроскопом. Сосредоточьтесь сначала на клетках, а затем на микрокатилляре, погруженной в культуру. Выбор округлых одноклеточных и приблизить микро капилляр к микроманипулятору.Приложить мягкое стремление с ручным управлением давлением на клетку, принимая его внутри микро капилляров Удалить одну клетку из первого образца и освободить его в поддержку клеточной культуры амеб. Затем инкубировать его при 30 градусах по Цельсию. Тщательно контролировать давление, чтобы иметь возможность стремиться к одной клетке и контролировать свое стремление путем наблюдения освобождения одной клетки.Проводите ежедневные наблюдения с помощью перевернутого оптического микроскопа, чтобы наблюдать за появлением клеток и следить за появлением цитопатический эффект. В настоящее время работает автоматизированная система экстракции для извлечения ДНК из части положительных образцов культуры, где наблюдается цитопатический эффект. Дизайн грунтовки для усиления бедных генов аннотированный как RBP2 для Фаустовируса, основные капсид белка usurpatvirus, и незначительные капсид белка для Clandestinovirus.Выполните стандартный ПЦР с помощью термоциклера в соответствии с рукописью. Выполнить 20 микролилитров ПЦР реакций с 50 микромолярной каждой грунтовки, 1X Master Mix, и рибонуклеазы свободной воды. Запустите продукты ПЦР с пятном геля ДНК на 1,5%агарозный гель при напряжении 135 вольт и визуализировать с УФ. Этот протокол оптимизирует процесс микроманипуляции с одноклеточной микроаспирации.Этот метод позволяет захватить округлую и зараженную амебу и ее выпуск в новой пластине, содержащей неинфицированные амебы. Этот подход успешно изолировал новый низкий изобилие гигантский вирус под названием Userpatvirus LCD7. Ваш Userpatvirus наблюдался только в клоне семь с наличием Userpatvirus LCD7 ДНК и отсутствие ДНК Фаустовируса.Электронная микроскопия выявила появление кландестиновируса ST1, который имеет типичную морфологию icosahedral без фибрилляций, а также Usurpatvirus LCD7 с икозахедраловым капсидом около 250 нанометров. Низкая цитометрия подтверждает перекрытие популяций Фаустовируса и Навуара. После освоения, эта процедура может быть сделано легко.Самое главное помнить при попытке этой процедуры является необходимость минимального ритуала наблюдения относительно размера лиц с хорошим обращением с компетентными рабочей станции и проверки любой проблемы загрязнения. Этот подход может быть использован в качестве метода сортировки на основе морфологии клеток. В настоящее время он используется в нашей лаборатории для клонирования конкретных амебы.Одним из важнейших этапов этого метода является поддержание целостности клеток. Действительно, у нас могут быть некоторые проблемы с не наблюдением за ячейкой или освобождением. Это связано главным образом с распадом клетки на микро капилляры.Этот метод может быть эффективной альтернативой, когда дефект телеметрии и сортировки фактов не доступны и когда конкретные ограничения техники достигнуты. Не забывайте, что в некоторых случаях клетка не высвобождается из микрокабрии. Отчасти это связано с характеристиками амеб и их способностью адаптироваться, а затем из клеточной мембраны.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Флуоресценция Активированный сортировки клеток растений Протопласты

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Бромдезоксиуридин (BrdU) Маркировка и последующих флуоресценции Активированный сотовый Сортировка по культуре независимой Определение растворенного органического углерода, разрушающих бактериопланктона

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Агарозном геле для разделения фрагментов ДНК

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Сотовые конкретного анализа<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Листья Использование флуоресценции клеток, активированных Сортировка

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Выделение нормальных и раковых связанных Фибробласты из свежих тканей флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Одноклеточный Микроинъекция для анализа сотовой связи

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Альтернативный подход к Подготовка проб с низкой Количество сотовых для анализа ПЭМ

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Флуоресценция активированная сортировка клеток для изоляции популяций склеакттинских клеток

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...