Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Författarna vill tacka både Jean-Pierre Baudoin och Olivier Mbarek för deras råd och Claire Andréani för hennes hjälp på engelska rättelser och modifieringar. Detta arbete stöddes av ett bidrag från den franska staten som förvaltas av den nationella forsknings byrån under "Investissements d' Avenir (investeringar för framtiden)" program med referensen ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée infektion) och av Région Provence Alpes Côte d'Azur och EU-finansiering FEDER PRIMI.

1. amoeba kultur
<ol><li>Använd Vermamoeba vermiformis (stam CDC19) som en cell stöd.</li>
	<li>Tillsätt 30 mL proteas-Peptone-jästextrakt-glukos medium (PYG) (tabell 1) och 3 ml av amöbae vid en koncentration av 1 x 106 celler/ml i en 75 cm2 cell odlings kolv.</li>
	<li>Bevara kulturen vid 28 ° c.</li>
	<li>Efter 48 h, kvantifiera amöbor använda räkna diabilder.</li>
	<li>För att skölja, skörda cellerna vid en koncentration av 1 x 106 celler/ml och...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

Varaktigheten av Single cell Micro-aspiration hantering och dess goda funktion är operatör-beroende. De olika stegen i experimentet kräver precision. Användningen av mikromanipuleringskomponenterna i arbetsstationen måste vara under ständig kontroll genom att observera processen för mikroaspiration och frisläppandet av cellen. Uppföljningen av mikroskopisk observation är nödvändig för avskiljning och överföring av en cell. En erfaren operatör kan ta 1 till 2 h för att isolera 10 celler och återöverför...

Nukleocytoplasmic stora DNA-virus (ncldv) är extremt varierande, definieras av fyra familjer som infekterar Eukaryoter1. De första beskrivna virusen med genom över 300 KBP var Phydcodnaviridae, inklusive paramecium Bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. Isoleringen och den första beskrivningen av Mimivirus visade att virusets storlek fördubblades både när det gäller partikelstorlek (450 nm) och genomets längd (1,2 MB)3. Sedan dess har många gigantiska virus beskrivits, vanligtvis isolerade med hjälp av en amoeba Co-Culture förfarande. Flera gigantiska virus med olika morfologier och genetiska innehåll kan isoleras från Acanthamoeba SP. celler, inklusive Marseilleviruses, Pandoraviruses, Pithovirusen, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, tupanvirus, och nyligen Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallellt, isolering av vermamoeba vermiformis tillåts isolering och beskrivning av jätten virus faustovirus, kaumoebavirus, och orpheovirus18,19,20. Andra gigantiska virus isolerades med sina värdprotister, såsom cafeteria roenbergensis21, aureococcus ansiefferens22, chrysochromulina patentifolium23och Bodo saltans 24. Alla dessa isoleringar var resultatet av ett ökande antal team som arbetar på isolering och införandet av hög genomströmning strategi uppdateringar25,26,27,28, såsom förbättring av co-Culture-systemet med hjälp av flödescytometri.
I 2016, vi använde en strategi som associerar Co-kultur och flödescytometri att isolera Giant virus27. Denna strategi utvecklades för att öka antalet prover inokulerade, att diversifiera protister som används som cell stöd, och att snabbt upptäcka lys av cell stöd. Systemet uppdaterades genom att lägga till ett kompletterande steg för att undvika preliminär molekylär biologi identifiering och snabb upptäckt av en okänd virus population som i fallet med Pacmanvirus29. Kopplingflödescytometri till cell sortering tillåten för separation av en blandning av Mimivirus och Cedratvirus A1130. Emellertid, vi stötte senare begränsningarna av separation och detektion av dessa virala subpopulationer av flödescytometri. Efter sekvensering, när vi monterade genomen av Faustovirus ST125 och FAUSTOVIRUS LCD7 (opublicerade data), Vi hittade förvånansvärt i varje församling två kompletterande genom av två nya virus som inte identifierats i offentliga Genome databaser. Men varken flödescytometri eller transmission elektronisk mikroskopi (TEM) visade att amoebaes var smittade av två olika virus, Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7. Vi har utformat specifika PCR-system för att förstärka markörer för Faustovirus, Usurpativirus och Clandestinovirus baserat på deras genom. vårt syfte var att ha PCR-baserade system som möjliggör verifiering av renheten hos de virus som separeras. Slutpunkts utspädning och flödescytometri kunde dock inte separera dem. Isoleringen av denna enda viral population var svår eftersom varken morfologin eller replikativa element av Clandestinovirus och Usurpativirus populationer har karakteriserats. Vi upptäckte endast en virus population genom flödescytometri på grund av överlappningen mellan de två populationerna (testad efter den effektiva separationen). Vi försökte separera dem med enkel partikel sortering på 96-bra tallrikar, men vi har inte observerat några cytopatiska effekter, och vi upptäckte varken Clandestinovirus eller Usurpativirus av PCR Amplification. Slutligen var det bara kombinationen av slutpunkt utspädning följt av en enda amoeba mikro-aspiration som möjliggjorde separation av dessa två låg-överflöd jätte virus från Faustoviruses. Denna separationsmetod är föremålet för denna artikel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

Under amoeba Co-Culture processen, mer än ett virus kan isoleras i en enda brunn. Vi löste tidigare denna fråga genom slutpunkt utspädning och/eller fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) tillämpas på virus populationen. Men när virusen i blandningen har liknande morfologiska egenskaper och ett av virusen multiplicerar långsamt, upptäcks närvaron av två virus i stadiet av arvsmassan och virusen kan inte separeras för ytterligare karakterisering. För att lösa detta problem, utvecklade vi en enda cell mikro-aspiration förfarande som möjliggör separation och kloning av mycket likartade virus. I det nuvarande arbetet presenterar vi hur denna alternativa strategi tillät oss att separera de små viral subpopulationer av Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7, jätte virus som växer långsamt och inte leder till amoebal Lys jämfört med den lytiska och snabbväxande Faustovirus. Renhetskontroll bedömdes genom specifik genamplifiering och virus producerades för ytterligare karakterisering.

Single cell Micro-aspiration är en mikromanipulation process optimerad i detta manuskript (figur 1). Denna teknik gör det möjligt att fånga en rundad, infekterad amoeba (figur 2a) och dess frisättning i en ny platta som innehåller oinfekterade amöbor (figur 2). Det är en funktionell prototyp som gäller för co-Culture-systemet och har framgångsrikt isolerat icke-lytiska jätte virus. Denna metod användes ...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Här beskriver vi en enda cell mikro-aspiration metod för separation av infekterade amoebae. För att separera viral subpopulationer i Vermamoeba vermiformis smittade av faustoviruses och okända jätte virus, utvecklade vi protokollet som beskrivs nedan och visat sin förmåga att separera två låg-överflöd roman Giant virus.

Single cell Micro-aspiration som en alternativ strategi för fluorescens-aktiverad cell sortering för Giant virus blandning separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Single Cell Micro-Aspiration är en metod för att komplettera de olika tekniker som används inom mikrobiologi i allmänhet och inom virologi i synnerhet. Det kunde svara på viktiga fråga och lösa problem som uppstått under jättevirus isolering genom att separera ett virus från en virusblandning presentera ett lågt överflöd Virus som det var fallet för omsättning virus, clandisinal virus, och uzibati virus från en annan, som är Faustovirus, närvarande i hög överflöd ändå. Den största fördelen med detta tillvägagångssätt är att man använder en indirekt strategi.Den består av att separera och klona den infekterade värden för att få en viral separation. Så övervakar denna metod de olika stegen från fångst till frisättning av celler och bekräfta sorteringsprocessen genom mikroskopisk observation. Slutligen används molekylärbiologi för att bekräfta sortering och elektronisk mikroskopi för att observera de separerade viruspartiklarna.Detta tillvägagångssätt kommer att lösa det stora problemet med virusseparation. Det är en prospektiv för kloning av ameba eller kloning protister i allmänhet. Den person som försöker använda denna teknik för första gången måste vara rigorös och exakt när du kontrollerar trycket.Den visuella kontrollen är avgörande för att bekräfta fångsten och frisläppandet av endast en cell. Använd Vermamoeba Vermiformis, stam CDC 19, som en cell stöd. Tillsätt 30 milliliter PYG-medium och tre milliliter av amöba vid en koncentration av en gånger tio till de sjätte cellerna per milliliter i en 75 kvadrat centimeter cellodlingskolv.Underhåll kulturen vid 28 grader Celsius i en inkubator. Efter 48 timmar, överför 10 milliliter av amöba cellkulturen på en räknande bild och placera den under ett mikroskop för att kvantifiera amöba. För att skölja, skörda 30 milliliter av cellkulturen i ett rör och pellet amöbaen genom centrifugation vid 720 gånger G i 10 minuter.Avlägsna supernatanten och resuspend pelleten i lämplig volym av svältmedium för att erhålla koncentrationen av en gånger 10 till de sjätte cellerna per milliliter. Förbered det cellulära stödet med tillägg av antimikrobiellt medel. I en biosäkerhet skåp, tillsätt en gånger 10 till den sjätte av amöba kultur i två milliliter av svält medium.Sedan inokulera 100 milliliter av stamlösningen som innehåller blandningen av virus i amöba cell kultur stöd vid en multiplicity av infektion av 0,01. Inkubera det infekterade amöbae cellen kultur stöd. Lägg till 30 grader Celsius i 10 till 14 timmar eller tills cytopatisk effekter induceras såsom amöbal avrundning eller lys.Använd sedan en spruta för att samla in media och filtrate genom ett fem mikronfilter för att ta bort cellulärt skräp. Utför en spannmålsutspädning av virusprovet i svältmedium i olika brunnar. Inokulera två milliliter av en gånger 10 till den sjätte Vermamoba Vermaformis som finns i varje Petriskål med 100 milliliter av blandningen inokulat.Placera sedan Petri-diskarna i en förslutningsbar plastpåse i 30 grader Celsius. Vid sex timmar efter infektion, observera Petri rätter med inverterad optisk mikroskopi och kontrollera cell morfologi var fjärde till åtta timmar. Den anti-mikrobiella behandlingen är för det cellulära stödet.Välj bland Petri-diskarna de som är frånvarande av någon visuell kontamination genom svamp- och bakteriemedel och med bevis för cytopatisk effekt av amöba på grund av virusen och med pre-lysis och avrundningsfasen av amöbaen för att undvika aspiration av viruspartiklar. Ställ in en arbetsstation med mikromanipulator, manuellt styrtrycksdon, inverterat mikroskop, Plug and Play Motor-moduler, kamera och datormodul. Välj en mikro kapillär av 20 mikron innerdiameter för att möjliggöra underhåll av en inre position och en enkel frisättning av cellen.Fixera greppsystemets driftsvinkel på den motoriserade modulen vid 45 grader. Utför en dubbel installation, först på greppsystemet och sedan på mikrokafillären. Fokusera på cellerna.För att klona celler, placera petriskålen som innehåller två milliliter infekterade amöba under mikroskopet. Fokusera först på cellerna och sedan på mikromönsatorn nedsänkt i kulturen. Plocka rundade enda cell och föra mikro kapillären närmare mikromanipulator.Utöva mjuk aspiration med manuell tryckreglering på cellen som tar den inuti mikrokafillären Ta bort den enda cellen från det första provet och släpp den i amöbaens cellodlingsstöd. Sedan inkubera den vid 30 grader Celsius. Kontrollera försiktigt trycket för att kunna aspirera en enda cell och kontrollera din strävan genom observation av frisättningen av en enda cell.Genomföra dagliga observationer med ett inverterat optiskt mikroskop för att observera cellernas utseende och för att övervaka uppkomsten av den cytopatiska effekten. Nu driva en automatiserad extraktion system för att extrahera DNA från en del av de positiva kulturprover där en cytopatisk effekt observeras. Design primers att förstärka fattiga gener kommenterade som RBP2 för Faustovirus, större capsid protein för Usurpatvirus, och mindre capsid protein för Clandestinovirus.Utför standard PCR med hjälp av en termocykler enligt manuskriptet. Utför 20 mikroliter pcr-reaktioner med 50 mikromolar av varje primer, 1X Master Mix, och ribonuclease fritt vatten. Kör PCR-produkterna med DNA-gelfläck på en 1,5%agarosgel vid spänningen på 135 volt och visualisera med UV. Detta protokoll optimerar en micromanipulation process med single cell micro aspiration.Denna teknik möjliggör fångst av en rundad och infekterad amöba och dess release i en roman platta som innehåller oinfekterade amöba. Detta tillvägagångssätt framgångsrikt isolerade en ny låg överflöd jätte virus som heter Userpatvirus LCD7. Din Userpatvirus observerades endast i klon sju med närvaro av Userpatvirus LCD7 DNA och avsaknad av Faustovirus DNA.Elektronmikroskopi avslöjade uppkomsten av Clandestinovirus ST1, som har en typisk icosahedral morfologi utan fibriller samt Usurpatvirus LCD7 med en icosahedral capsid av cirka 250 nanometer. Låg cytometri bekräfta överlappande populationer av Faustovirus och Nauvoirus. När behärskar, kan detta förfarande göras enkelt.Det viktigaste att komma ihåg när man försöker detta förfarande är nödvändigheten av en minsta observationer ritual som rör storleken på de enheter med god hantering av den behöriga av arbetsstationen och kontroll av eventuella föroreningsproblem. Detta tillvägagångssätt kan användas som en sorteringsteknik på grundval av cellmorfologi. För närvarande används det i vårt laboratorium för kloning av specifika amöba.En kritisk punkt i denna teknik är att upprätthålla cellen integritet. I själva verket kan vi ha vissa problem med icke observation av cellen eller frisättning. Detta beror mest på sönderfall av cellen i mikro kapillären.Denna metod skulle kunna vara ett effektivt alternativ när fel telemetri och faktasortering inte är tillgängliga och när specifika teknik begränsningar nås. Glöm inte att i vissa fall cellen inte frigörs från mikro kapillären. Detta beror delvis på amöbae egenskaper och deras förmåga att anpassa sig och sedan från cellmembranet.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) märkning och Efterföljande Fluorescens Aktiverat cellsortering för kultur-oberoende identifiering av löst organiskt kol-nedbrytande bakterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosgelelektroföres för separation av DNA-fragment

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell särskild analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blad Använda fluorescensaktiverad cellsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolering av normala och cancer-associerade fibroblaster från färska vävnader genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Encelliga mikroinjektion för analys Cell Communication

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi för känsliga, storskaliga kvantitativa Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Ett alternativt tillvägagångssätt för provberedning med låg mobilnummer för TEM-analys

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Fluorescensaktiverad cellsortering för isolering av scleractinian cell populationer

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...