Name: single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Yazarlar hem Jean-Pierre Baudoin ve Olivier Mbarek kendi tavsiye ve Claire Andréani İngilizce düzeltmeler ve değişiklikler ona yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Anr-10-IAHU-03 (Méditerranée Enfeksiyonu) referansı ile "Investissements d'avenir (Gelecek için Yatırımlar)" programı kapsamında Ulusal Araştırma Ajansı tarafından yönetilen Fransız Devleti'nin bağışı ile desteklenmiştir. Côte d'Azur ve Avrupa finansman FEDER PRIMI.

1. Amip Kültürü
<ol><li>Bir hücre desteği olarak Vermamoeba vermiformis (zorlanma CDC19) kullanın.</li>
	<li>75 cm2 hücre kültürü şişesinde 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonunda 30 mL proteease-pepton-maya ekstresi-glikoz ortamı (PYG)ve 3 mL amip ekleyin.</li>
	<li>28 °C'de kültürünü koruyun.</li>
	<li>48 saat sonra, sayma slaytları kullanarak amip miktarını ölçün.</li>
	<li>Durulama için, 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonda hücreleri hasa...

<ol>
	<li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses.">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome.">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li><li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Giant+Virus+in+Amoebae.">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033 (2003).</li><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba.">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology.">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum,+a+new+30,000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba.">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family.">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).</li><li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses.">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus,+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus,+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses.">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300 (2016).</li><li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses.">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372 (2018).</li><li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity.">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution.">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li><li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae.">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76 (2016).</li><li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medusavirus,+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water.">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes.">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).</li><li>Abrah&#227;o, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere.">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).</li><li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faustovirus,+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae.">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li><li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaumoebavirus,+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae.">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orpheovirus+IHUMI-LCC2:+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses.">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).</li><li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton.">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li><li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+brown+tide+virus+(AaV),+the+little+giant+of+the+Megaviridae,+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution.">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li><li>Gallot-Lavall&#233;e, L., Blanc, G., Claverie, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+(CeV)+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family.">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Deeg, C. M., Chow, C. -. E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+(BsV),+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea.">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235 (2018).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining.">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).</li><li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis.">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).</li><li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses.">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li><li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacmanvirus,+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses.">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li><li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants.">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells.">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li><li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).</li><li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse.">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li></ol>

Tek hücreli mikro-aspirasyon işleme süresi ve iyi çalışması operatöre bağlıdır. Deneyin farklı adımları kesinlik gerektirir. İş istasyonunun mikromanipülasyon bileşenlerinin kullanımı, mikro-aspirasyon sürecini ve hücrenin salınımını gözlemleyerek sürekli kontrol altında olmalıdır. Mikroskobik gözlem ile takip bir hücrenin yakalanması ve transferi için gereklidir. Deneyimli bir operatör 10 hücreleri izole etmek ve izole edilecek virüslerin bolluğuna bağlı olarak tek tek aktarmak i...

Nükleozositoplazmik büyük DNA virüsleri (NCLDV) ökaryotlara bulaşandört aile tarafından tanımlanan son derece çeşitlidir. 300 kbp üzerinde genomları ile ilk açıklanan virüsler Phydcodnaviridaeedildi , Paramecium bursaria Chlorella virüsü dahil 1 PBCV12. İzolasyon ve Mimivirüs ilk açıklaması, virüslerin boyutu parçacık (450 nm) ve genom uzunluğu (1.2 Mb)3hem boyutu açısından iki katına gösterdi . O zamandan beri, birçok dev virüs, genellikle bir amip co-kültür prosedürü kullanılarak izole tarif edilmiştir. Farklı morfolojileri ve genetik içeriği ile birçok dev virüs Marsilyavirüsler, Pandoravirüsler, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus ve son zamanlarda dahil olmak üzere Acanthamoeba sp. hücreleri, izole edilebilir Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Buna paralel olarak, Vermamoeba vermiformis izolasyon izolasyon ve dev virüsler Faustovirus, Kaumoebavirus ve Orpheovirus18, 19,20açıklamasına izin verdi. Diğer dev virüsler kafeterya roenbergensis21gibi ev sahibi protistler ile izole edildi, Aureococcus anoofagefferens22, Chrysochromulina ericina23, ve Bodo saltans 24. yıl. Tüm bu izolasyonlar izolasyon ve yüksek iş-iş stratejisi güncellemeleri25,26,27,28,gibi giriş üzerinde çalışan ekiplerin artan sayıda sonucu akış sitometrisi kullanımı ile ortak kültür sisteminin iyileştirilmesi.
2016 yılında, dev virüsleri izole etmek için ortak kültür ve akış sitometrisini ilişkilendiren bir strateji kullandık27. Bu strateji aşılanan numune sayısını artırmak, hücre desteği olarak kullanılan protistleri çeşitlendirmek ve hücre desteğinin düzgünliğini hızlı bir şekilde tespit etmek için geliştirilmiştir. Sistem pacmanvirus29durumunda olduğu gibi ön moleküler biyoloji kimlik ve bilinmeyen bir viral popülasyonun hızlı tespiti önlemek için ek bir adım ekleyerek güncellendi . Mimivirüs ve Cedratvirus A1130karışımının ayrılmasıiçin izin verilen hücre ayrıştırma için kaplin akış sitometri . Ancak daha sonra bu viral alt popülasyonların akış sitometrisi ile ayrılması ve saptanması ile ilgili sınırlamalarla karşılaştık. Sıralamadan sonra, Faustovirus ST125 ve Faustovirus LCD7 (yayınlanmamış veriler) genomlarını bir araya getirdiğimizde, şaşırtıcı bir şekilde her derlemede, kamu genom veritabanlarında tanımlanmamış iki yeni virüsün iki ek genomunu bulduk. Ancak, ne akış sitometrisi ne de iletim elektronik mikroskopi (TEM) amiplerin iki farklı virüs, Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7 ile enfekte olduğunu gösterdi. Faustovirüs, Usurpativirus ve Clandestinovirus belirteçlerini sırasıyla genomlarına göre güçlendirmek için özel PCR sistemleri tasarladık; amacımız, ayrılan virüslerin saflıklarının doğrulanmasını sağlayan PCR tabanlı sistemlere sahip olmaktı. Ancak, son nokta seyreltme ve akış sitometri onları ayırmak için başarısız oldu. Clandestinovirus ve Usurpativirus popülasyonlarının ne morfolojisi ne de çoğaltıcı elementleri karakterize edilmediği için bu tek viral popülasyonun izole edilmesi zordu. İki popülasyonun üst üste binme (etkili ayrışma sonrasında test edildiği) nedeniyle akış sitometrisi ile sadece bir viral popülasyon tespit ettik. 96 kuyulu plakalarda tek partikül ayrıştırma kullanarak ayırmaya çalıştık, ancak herhangi bir sitopatik etki gözlemlemedik ve PCR amplifikasyon uğramı ile ne Clandestinovirus ne de Usurpativirus tespit ettik. Son olarak, faustovirüsler bu iki düşük bolluk dev virüslerin ayrılmasını etkin tek amip mikro-aspirasyon izledi sadece uç nokta seyreltme kombinasyonu oldu. Bu ayırma yöntemi bu makalenin nesnesidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1068px;" width="1067">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose Standard</td>
			<td style="width:185px;">Euromedex</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td style="width:391px;">Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">4398876</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CellTram 4r Oil</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5196000030</td>
			<td>Control the cells during the microaspiration process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 150 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430825</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430639</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Corning cell culture flasks 75 cm2</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">CLS430641</td>
			<td>Culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DFC 425C camera</td>
			<td style="width:185px;">LEICA</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Observation/Monitoring</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">EZ1 advanced XL</td>
			<td style="width:185px;">Quiagen</td>
			<td style="width:161px;">9001874</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glasstic Slide 10 With Counting Grids</td>
			<td style="width:185px;">Kova International</td>
			<td style="width:161px;">87144E</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Mastercycler nexus</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">6331000017</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Microcapillary 20 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5175 107.004</td>
			<td>Microaspiration and release of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Micromanipulator InjectMan NI2</td>
			<td style="width:185px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">631-0210</td>
			<td>Microcapillary positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:185px;">ThermoFischer</td>
			<td style="width:161px;">AM9920</td>
			<td>Standard PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Optima XPN Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">A94469</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Petri dish 35 mm</td>
			<td style="width:185px;">Ibidi</td>
			<td style="width:161px;">81158</td>
			<td>Culture/observation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Sterile syringe filters 5 &#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:161px;">SLSV025LS</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR green Type I</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">unknown</td>
			<td>Fluorescent molecular probes/ flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">S33102</td>
			<td>Standard PCR; DNA gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tecnai G20</td>
			<td style="width:185px;">FEI</td>
			<td style="width:161px;">Unkown</td>
			<td>Electron microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">337922</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm</td>
			<td style="width:185px;">BECKMAN COULTER</td>
			<td style="width:161px;">344058</td>
			<td>Virus purification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell micro-aspiration as an alternative strategy to fluorescence-activated cell sorting for giant virus mixture separation

Amip ortak kültür süreci sırasında, birden fazla virüs tek bir kuyuda izole edilebilir. Daha önce bu sorunu, viral popülasyona uygulanan son nokta seyreltme ve/veya floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile çözmüştük. Ancak, karışımdaki virüsler benzer morfolojik özelliklere sahip olduğunda ve virüslerden biri yavaş yavaş çoğaldığında, genom montaj aşamasında iki virüsün varlığı keşfedilir ve virüsler daha fazla karakterizasyon için ayrılamaz. Bu sorunu çözmek için, son derece benzer virüslerin ayrılması ve klonlanmasına olanak tanıyan tek bir hücreli mikro aspirasyon prosedürü geliştirdik. Bu çalışmada, bu alternatif strateji bize Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7, yavaş büyüyen ve amipli ve hızlı büyüyen göre amip lisis yol açmaz dev virüslerin küçük viral alt popülasyonları ayırmak için izin nasıl sayılmızı sıyoruz Faustovirüs. Saflık kontrolü spesifik gen amplifikasyonu ile değerlendirildi ve daha fazla karakterizasyon için virüsler üretildi.

Tek hücreli mikro-aspirasyon bu el yazmasında optimize edilmiş bir mikromanipülasyon işlemidir (Şekil 1). Bu teknik, yuvarlak, enfekte olmuş bir amipin(Şekil 2A)yakalanmasını ve enfekte olmamış amipiçeren yeni bir plaka içinde serbest bırakılmasını sağlar (Şekil 2). Ortak kültür sistemine uygulanan ve litik olmayan dev virüsleri başarıyla izole eden işlevsel bir prototiptir. Bu yaklaşım d...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation at JoVE.com

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Burada, enfekte amiplerin ayrılması için tek bir hücreli mikro-aspirasyon yöntemini tanımlıyoruz. Faustovirüsler ve bilinmeyen dev virüsler tarafından enfekte Vermamoeba vermiformis viral alt popülasyonları ayırmak için, aşağıda ayrıntılı protokolü geliştirdi ve iki düşük bolluk yeni dev virüs ayırma yeteneğini gösterdi.

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Tek Hücreli Mikro-Aspirasyon, genel olarak mikrobiyoloji alanında ve özellikle virolojide kullanılan farklı teknikleri tamamlayan bir yöntemdir. Bu ciro virüsler, klozzial virüs ve uzibati virüsü başka bir, faustovirus, zaten yüksek bolluk mevcut olduğu gibi düşük bolluk Virüs sunan bir viral karışımdan bir virüs ayırarak anahtar soru cevap ve sorunları çözmek olabilir. Bu yaklaşımın en büyük avantajı dolaylı bir stratejinin kullanılmasıdır.Bu ayıran ve viral bir ayrım elde etmek için enfekte konak klonlama oluşur. Yani, bu yöntem hücrelerin salınımına yakalamadan farklı adımları izler ve mikroskobik gözlem ile sıralama işlemini onaylar. Son olarak, moleküler biyoloji ayrılmış viral parçacıkları gözlemlemek için sıralama ve elektronik mikroskopi onaylamak için kullanılır.Bu yaklaşım virüs ayırma büyük sorunu çözecektir. Bu genel olarak ameba klonlama veya protistler klonlama için bir prospektif. Bu tekniği ilk kez kullanmaya çalışan kişi basıncı kontrol ederken titiz ve hassas olmalıdır.Yalnızca bir hücrenin yakalanmasını ve serbest bırakılmasını onaylamak için görsel kontrol gereklidir. Vermamoeba Vermiformis kullanın, suş CDC 19, bir hücre desteği olarak. 75 santimetre karelik hücre kültürü şişesinde mililitre başına altıncı hücrelere bir kere on konsantrasyonla 30 mililitre PYG orta ve üç mililitre amip ekleyin.Bir kuvözde 28 santigrat derecede kültürü koruyun. 48 saat sonra, bir sayma slayt üzerine amip hücre kültürünün 10 mililitre aktarın ve amip ölçmek için bir mikroskop altında yerleştirin. Durulama için, bir tüp içinde hücre kültürünün 30 mililitre hasat ve 10 dakika için 720 kez G santrifüj ile amip pelet.Supernatant çıkarın ve mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 konsantrasyonelde etmek için açlık orta uygun hacimde pelet resuspend. Antimikrobiyal ajan ilavesi ile hücresel destek hazırlayın. Bir biyogüvenlik kabinesinde, iki mililitre açlık ortamına amip kültürünün altıncısına 10 kez ekleyin.Daha sonra 0.01 enfeksiyon çokluğu amip hücre kültürü destek içine virüs karışımı içeren stok çözeltisi 100 mililitre aşılayın. Enfekte amip hücre kültürü desteği kuluçka. 10 ila 14 saat veya sitopatik etkileri amip yuvarlama veya lysis gibi indüklenene kadar 30 derece santigrat ekleyin.Daha sonra, medya toplamak ve hücresel enkaz kaldırmak için beş mikron filtre ile filtrrate toplamak için bir şırınga kullanın. Farklı kuyularda açlık orta viral örnek bir tahıl seyreltme gerçekleştirin. Bir kez iki mililitre aşılamak 10 altıncı Vermamoba Vermaformis karışımı inoculum 100 mililitre ile her Petri kabında bulunan.Sonra, Petri kaplarını 30 santigrat derecede mühürlenebilir bir plastik torbaya yerleştirin. Enfeksiyon sonrası altı saat, ters optik mikroskopi ile Petri kapları gözlemlemek ve hücre morfolojisi her dört ila sekiz saatte bir kontrol edin. Anti-mikrobiyal tedavi hücresel destek içindir.Petri yemekleri arasında mantar ve bakteriyel ajanlar tarafından herhangi bir görsel kontaminasyon olmayan ve virüsler nedeniyle amip sitopatik etkisi kanıt ve viral parçacıkların aspirasyon önlemek için amip öncesi lizis ve yuvarlama fazı ile seçin. Mikro manipülatör, manuel kontrol basınç cihazı, ters mikroskop, Tak ve Çalıştır Motor modülleri, kamera ve bilgisayar modülü ile bir iş istasyonu ayarlayın. Bir iç pozisyon ve hücrenin kolay bir serbest bakımı sağlamak için 20 mikron iç çapı bir mikro kılcal seçin.Motorlu modüldeki kavrama sisteminin çalışma açısını 45 derecede düzeltin. Bir çift kurulum gerçekleştirin, ilk kavrama sistemi ve daha sonra mikro kılcal. Hücrelere odaklan.Hücreleri klonlamak için, mikroskop altında enfekte amip iki mililitre içeren Petri çanak yerleştirin. Önce hücrelere, sonra da kültüre dalmış mikro kılcal damarlara odaklanın. Yuvarlak tek hücreyi seçmek ve mikro kılcal damarı mikromanipülatöre yaklaştırmak.Mikro kılcal damarın içine alarak hücre üzerinde manuel basınç kontrolü ile yumuşak aspirasyon uygulayın İlk örnekten tek hücreyi çıkarın ve amip hücre kültürü desteği bırakın. Sonra 30 derecede kuluçkaya yat. Tek bir hücreyi arzulayabilmek için basıncı dikkatlice kontrol edin ve tek bir hücrenin salınımını gözlemleyerek aspirasyonunuzu kontrol edin.Hücrelerin görünümünü gözlemlemek ve sitopatik etkinin ortaya çıkışını izlemek için ters optik mikroskopla günlük gözlemler gerçekleştirin. Şimdi sitopatik etki gözlenen pozitif kültür örneklerinin bir kısmından DNA çıkarmak için otomatik bir ekstraksiyon sistemi çalıştırın. Faustovirus için RBP2, Usurpatvirus için majör kapsid proteini ve Clandestinovirus için minör kapsid proteini olarak eklenmiş kötü genleri güçlendirmek için tasarım astarları.El yazmasına göre bir termocycler kullanarak standart PCR gerçekleştirin. Her astar, 1X Master Mix ve ribonükleaz içermeyen su 50 mikromolar ile PCR reaksiyonları 20 mikroliliters yürütmek. PCR ürünlerini 135 volt voltajda %1,5 agarose jel üzerinde DNA jeli lekesi ile çalıştırın ve UV ile görselleştirin. Bu protokol tek hücreli mikro aspirasyon ile bir mikromanipülasyon süreci optimize eder.Bu teknik, yuvarlak ve enfekte amip lerin yakalanmasını ve enfekte olmamış amipiçeren yeni bir plaka içinde piyasaya sürülmesini sağlar. Bu yaklaşım başarıyla Userpatvirus LCD7 adlı yeni bir düşük bolluk dev virüs izole. Userpatvirus'unuzun sadece 7.Elektron mikroskopisi, fibriller olmadan tipik bir ikosahedral morfolojisi olan Clandestinovirus ST1'in yanı sıra yaklaşık 250 nanometre lik bir ikosahedral kapsidile Usurpatvirus LCD7 görünümünü ortaya çıkardı. Düşük sitometri Faustovirus ve Nauvoirus popülasyonlarının örtüştünşunu doğrular. Bir kez hakim, bu yordamı kolayca yapılabilir.Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, iş istasyonunun yetkin lerinin iyi idaresi ve herhangi bir kontaminasyon sorununun kontrolü ile varlıkların büyüklüğü ile ilgili minimum gözlem ritüelinin gerekliliğidir. Bu yaklaşım hücre morfolojisi temelinde bir sıralama tekniği olarak kullanılabilir. Şu anda laboratuarımızda belirli amiplerin klonlanmasında kullanılmaktadır.Bu tekniğin kritik noktalarından biri hücre bütünlüğünü korumaktır. Gerçekten de, biz hücre veya serbest olmayan gözlem ile bazı sorunlar olabilir. Bu çoğunlukla mikro kılcal içine hücrenin parçalanması kaynaklanmaktadır.Bu yöntem, kusur telemetrisi ve olgu sıralama sıyrık kullanılamadığında ve belirli teknik sınırlamaları elde edildiğinde etkili bir alternatif olabilir. Bazı durumlarda hücre mikro kılcal serbest olmadığını unutmayın. Bu kısmen amip özellikleri ve uyum ve daha sonra hücre zarından kapasite kaynaklanmaktadır.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

DNA kırıntıları Ayrılma Agaroz Jel Elektroforezi

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Skleraktin Hücre Popülasyonlarının İzolasyoniçin Floresan-Aktive Hücre Sıralaması

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...