Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

نشكر الدكتورة سوزان زوللا بازنر في قسم الطب وقسم الأحياء الدقيقة في كلية إيكان للطب في جبل سيناء على مراجعة المخطوطات. وقدمت المؤسسة الوطنية للصحة/المعهد الوطني للصحة/المعهد الوطني للصحة/المركز الوطني للصحة/المركز الوطني للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة والقضاء على تنفيذ القدرات تمويلاً لهذا المشروع في إطار المنحة رقم R21 HD0 وبالإضافة إلى ذلك، تلقى ر. باول الدعم من أموال من قسم الطب، شعبة الأمراض المعدية، كلية إيكان للطب في جبل سيناء.

تم تعيين كل مشارك في هذه الدراسة واستجوابه وفقًا لموافقة مجلس المراجعة الأخلاقية والمؤسسية (IRB) مع توجيه وترخيص برنامج جبل سيناء لحماية البشر (PPHS) باستخدام موافقة مجلس الهجرة واللاجئين بروتوكول للحصول على عينات حليب الثدي.
1 - إعداد الهدف للغلاف الجزئي
<ol>...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk.">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li><li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons.">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring:+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth.">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li><li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals.">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li><li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding:+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer's+Patches+of+the+Nursed+Infant.">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).</li><li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates.">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).</li><li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants.">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries:+a+pooled+analysis.">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies.">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li><li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1.">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).</li><li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+(ADCC)+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality.">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li><li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1.">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li><li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody Fc. , (2014).</li><li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

وقد وُصفت لأول مرة في عام 201130 تقنية قياس التدفق القائم على قياس السيتومترية لقياس نشاط ADCP الوارد وصفها هنا، وقد ثبت منذ ذلك الحين أنها قوية واستشهد بها في أكثر من 80 دراسة. البروتوكول الموصوف هنا يتكيف مع هذه التقنية للاستخدام مع خلايا BM الأولية للمرة الأولى. كانت الدراسات السا...

يتكون حليب الثدي البشري (BM) من خلايا الأمومة التي هي > 90٪ قابلة للحياة1. يتأثر تكوين الخلية بشدة بمرحلة الرضاعة، والحالة الصحية للأم والرضيع، والتباين الفردي، الذي لا يزال غير مفهومبشكلجيد1،2،3،4. وبالنظر إلى أن BM يحتوي على ~ 103−105 الكريات البيض / مل، يمكن تقدير أن الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأم يوميا5. وقد أظهرت دراسات مختلفة في الجسم الحي أن الكريات البيض الأمومية توفر مناعة حرجة للطفل وتعمل بشكل جيد خارج هذه المواقع من الابتلاع الأولي5و6و7و8 ،9،10،11. جميع الخلايا المشتقة من الأمومة التي ابتلعها الرضيع لديها القدرة على أداء وظائف المناعة جنبا إلى جنب أو للتعويض عن الكريات البيض الخاصة بالرضيع12.
ولا يزال انتقال فيروس نقص المناعة البشرية من الأم إلى الطفل يشكل أزمة في البلدان المحدودة الموارد. وبما أن أمراض الإسهال والجهاز التنفسي مسؤولة عن معدلات كبيرة من الوفيات بين الرضع في البلدان المحدودة الموارد، وهذه الأمراض تنخفض بدرجة كبيرة عن طريق الرضاعة الطبيعية الخالصة، والفوائد التي تعود على الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية من الرضاعة الطبيعية تفوق بكثير المخاطر13،14،15. وما لم يكن الحصول على المياه النظيفة وحليب الرضع المناسب موثوقاً به، فإن منظمة الصحة العالمية لا توصي بوقف الرضاعة الطبيعية للأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية16. ويحدث سنوياً ما يقرب من 000 100 طن متري من الـ MTCT عن طريق BM؛ حتى الآن، فقط ~ 15٪ من الرضع الرضاعة الطبيعية من قبل أمهاتهم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية تصبح مصابة، مما يشير إلى تأثير وقائي قوي من BM17،18،19،20،21. ومن المرجح أن تعمل عوامل عديدة جنبا إلى جنب لمنع انتقال العدوى. والأهم من ذلك أن الأجسام المضادة الخاصة بفيروس نقص المناعة البشرية (Abs) في BM قد ارتبطت بانخفاض انتقال العدوى من الأم إلى الطفل و/أو انخفاض وفيات الرضع بسبب الإصابة بفيروس نقصالمناعةالبشرية22و23. ما لا يزال غير واضح إلى حد كبير هو مساهمة الجزء الخلوي من BM لصفاته المضادة للفيروسات.
العديد من Abs تسهيل مجموعة متنوعة من الأنشطة المضادة للفيروسات بوساطة المنطقة 'ثابتة' من جزيء الغلوبولين المناعي، والجزء القابل للتبلور (Fc)، عن طريق التفاعل مع مستقبلات Fc (FcRs) وجدت على جميع الخلايا المناعية الفطرية تقريبا، وكلها تقريبا موجودة في الإنسان BM24. وقد ثبت أن الفيغوسياتوsات الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP) ضرورية لإزالة العدوى الفيروسية، وقد تم دراسة ناقصة في حالة الوقاية من انتقال الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية25،26،27، 28 , 29.نظرا لندرة المعرفة حول المساهمة المحتملة لنشاط ADCP من قبل phagocytes BM للوقاية من انتقال انتقال الإصابة من الأم إلى الطفل من فيروس نقص المناعة البشرية، كنا نهدف إلى تطوير طريقة صارمة لعزل الخلايا من BM البشرية من أجل إجراء دراسة للADCP بوساطة الخلايا من BM التي تم الحصول عليها في مراحل مختلفة من الرضاعة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

وحتى في غياب العقاقير المضادة للفيروسات العكوسة، فإن حوالي 15 في المائة فقط من الرضع الذين ترضعهم الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية يصابون بالعدوى، مما يشير إلى وجود تأثير وقائي قوي لحليب الثدي. وما لم يكن الحصول على المياه النظيفة وحليب الرضع المناسب موثوقاً به، فإن منظمة الصحة العالمية لا توصي بوقف الرضاعة الطبيعية للأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية. ومن المرجح أن تعمل عوامل عديدة جنبا إلى جنب للحد من انتقال BM. الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأمومية يوميا، على الرغم من أن ما لا يزال غير واضح إلى حد كبير هو مساهمة هذه الخلايا في الصفات المضادة للفيروسات من BM. في الوقت الحاضر كنا نهدف إلى عزل الخلايا من BM الإنسان من أجل قياس الفيغوسيات الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP)، وهي واحدة من الاستجابات المناعية الفطرية الأكثر أهمية وانتشاراً، من قبل خلايا الفيغاسضدية BM ضد أهداف فيروس نقص المناعة البشرية. تم عزل الخلايا من 5 عينات BM البشرية التي تم الحصول عليها في مراحل مختلفة من الرضاعة. تم إجراء العزلة عن طريق الطرد المركزي لطيف تليها إزالة دقيقة من الدهون الحليب والغسيل المتكرر من بيليه الخلية. وقد استخدمت حبات الفلورسنت المغلفة بغلاف فيروس نقص المناعة البشرية (Env) كأهداف لتحليل ADCP. كانت الخلايا ملطخة بعلامة سطح CD45 لتحديد الكريات البيض. وتبين أن نشاط برنامج مكافحة المخدرات كان كبيرا فوق تجارب المراقبة ويمكن قياسه بشكل قابل للقياس باستخدام جسم مضاد خاص بفيروس نقص المناعة البشرية 830A.

يمكن الاحتفاظ بالحليب في درجة حرارة الغرفة أو برودة (وإن لم تكن مجمدة)؛ ومع ذلك، وبالنظر إلى أننا لاحظنا انخفاض القدرة على البقاء عندما تم الاحتفاظ الحليب الباردة جدا (البيانات لم تظهر)، وأنه من الأبسط لجمع وتخزين لفترة وجيزة، والنقل في درجات الحرارة المحيطة، فمن المستحس...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

وينقل حليب الثدي فيروس نقص المناعة البشرية، على الرغم من أن حوالي 15 في المائة فقط من الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية من الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية يصابون بالعدوى. الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأمومية يوميا، على الرغم من أن هذه الخلايا هي أقل دراسة. هنا نقوم بوصف عزل ة حليب الثدي الكريات البيض وتحليل قدرتها الفصوتية.

عزل الكريات البيض عن حليب الثدي البشري للاستخدام في فحص الفيغوسية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لأهداف فيروس نقص المناعة البشرية

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

لقد طورنا طريقة صارمة لعزل الخلايا من حليب الثدي البشري لدراسة البلعة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة ، أو ADCP ، عن طريق برامعات حليب الثدي ضد أهداف فيروس نقص المناعة البشرية. هذه التقنية تسهل عزل خلايا حليب الأم بسرعة وسهولة نسبيا لتقييم قدرة السكان الكريات البيض على أداء ADCP. إثبات الإجراء سيكون أليسا فوكس، فني من مختبري.بعد اختيار مستضد الهدف ذات الصلة، واستخدام مجموعة تجارية لبيوتينيل البروتين من الفائدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. و تودع العينة الحيوية في الغرفة العليا لعمود الدوران. أضف برنامج PBS ما يصل إلى 400 ميكروليتر وسقف الغرفة قبل إدخال العمود في أنبوب جمع للطرد المركزي.بعد التخلص من تدفق من خلال، إضافة برنامج تلفزيوني إلى 400 ميكرولترات للطرد المركزي الثاني. تجاهل التدفق من خلال، إضافة برنامج تلفزيوني إلى 400 ميكرولترات، وقياس تركيز البروتين بواسطة مقياس الطيفي لتقارن البروتين الحيوي إلى ميكرومتر microspheres. احتضان ستة ميكروغرام من البروتين مع 12 ميكرولتر من الخرز الأسهم في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل لوحة من الخرز مترافق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، مع دوامة لطيف كل 20 دقيقة.في نهاية الحضانة، بيليه الخرز البروتين مترافق بواسطة الطرد المركزي والتخلص من اجور. بعد دوامة لطيف، resuspend البروتين في 1200 ميكرولترات من 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني، وغسل الأنبوب عن طريق الطرد المركزي مرتين أكثر كما هو موضح للتو. بعد الغسيل الأخير، resuspend بيليه في 1200 microliters في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى BSA.لإعداد لوحات ADCP فحص، أولا إعداد 12 المخففات ميكرولتر من الأجسام المضادة، أو المصل المناعي من الفائدة، في 2٪ BSA في برنامج تلفزيوني في أسفل جولة 96 لوحة جيدا. إضافة 10 ميكرولترات من البروتين الخرز مترافق في بئر إلى لوحة لمدة ساعتين حضانة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، إضافة 200 microliters من برنامج تلفزيوني زائد BSA.بعد الحصول على حليب الثدي البشري من النساء المرضعات صحية التعبير عن استخدام مضخة، في غضون أربع ساعات من التعبير فصل محتويات الحليب عن طريق الطرد المركزي وتصب بعناية قبالة الحليب الخالي من الدسم والدهون، وترك بيليه الخلية دون عائق. امسح داخل الأنبوب بمسح خال من الوبر لإزالة جميع الدهون من جدار الأنبوب وإضافة 10 ملليلترات من PBS بالإضافة إلى HSA. Resuspend بيليه مع الأنابيب لطيف لتجنب تنشيط الخلية في موت الخلايا، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي.بعد غسل الثانية في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى HSA كما أظهرت للتو، resuspend بلطف الخلايا في 1-2 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى HSA للعد. لADCP الفحص، عكس بسرعة لوحة ADCP أعدت لdedeantant supernatant بعد الطرد المركزي النهائي وإضافة خمس مرات 10 في خلايا حليب الثدي المعزولة حديثا الرابعة في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني زائد BSA لمدة ساعتين حضانة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي الخلايا وغسل الكريات مرتين في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد كما هو موضح.بعد الغسيل الأخير، وصمة عار الخلايا مع 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من وصمة عار قابلة للإصلاح 450 في البئر في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وحمايتها من الضوء. في نهاية الحضانة، بيليه الخلايا لاثنين من يغسل في برنامج تلفزيوني جديد كما هو موضح، وصمة عار الخلايا لعلامات الكريات البيض من الفائدة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وجمع الطرد المركزي الخلايا، وغسل الخلايا مرتين في 200 ميكرولترات من 1٪ BSA زائد برنامج تلفزيوني لكل غسل.بعد الغسيل الأخير، قم بإصلاح الكريات في 200 ميكرولترات بنسبة 0.5٪ الفورمالديهايد لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. لتحليل تدفق الخلايا عينات الخلية، تعيين تدفق مقياس الخلايا مجهزة قارئ لوحة عالية الإنتاجية لسحب 175 ميكرولترات من العينة وجمع 5000 خلية في بئر. تنفيذ الغواينغ الأولي للقضاء على doublets والحطام على مبعثر إلى الأمام مقابل الجانب مبعثر مؤامرة.استخدام الجانب مبعثر مقابل مؤامرة وصمة عار قابلة للحياة للقضاء على الخلايا الميتة. واستخدام الجانب مبعثر مقابل مؤامرة CD45 للتمييز بين الفئات الكريات البيض الرئيسية. لجميع الخلايا الإيجابية CD45، أو لكل مجموعة فرعية الكريات البيض من الفائدة، وقياس نشاط البلعميات الخلوية تعتمد على الأجسام المضادة عن طريق الغوط مع علامة على الخلايا الإيجابية حبة في الرسم البياني من قناة الفلوروفور المناسبة للخرزات المقترنة.ثم حساب الأجسام المضادة تعتمد على درجات البلعميات الخلوية كما متوسط كثافة الفلوريسنس من الخلايا الإيجابية حبة بنسبة من مجموع CD45 بالإضافة إلى الخلايا في السكان إيجابية. هنا، يتم عرض استراتيجية البوابات لإزالة doublets، والحطام، والخلايا الميتة. بين واحد إلى 12٪ من مجموع الخلايا الحية هي عادة CD45 الكريات البيض إيجابية مع معظم الجانب المزعومة مبعثر منخفضة إلى وسيطة CD45 monocytes منخفضة تظهر لتكون السلائف، أو الخلايا غير ناضجة، على أساس تشتت الجانب مقابل CD45 الغات.يتم تعريف الحبيبات المزعومة على أنها الجانب مبعثر عالية، الخلايا المتوسطة CD45. قياس نشاط ADCP من خلايا حليب الثدي المعزولة حديثا باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة البشرية محددة فيروس نقص المناعة البشرية في شهر واحد بعد الولادة يكشف عن أن العلاج مع مثبطات أكتين Cytochalasin D أو مستقبلات Fc منع الأجسام المضادة قبل الحضانة مع مضادات ملزمة الخرز مقرن نتائج في نشاط ADCP في أو أقل التي لوحظت في وجود الأجسام المضادة السيطرة. درجة ADCP تحديد مجموع الخلايا الإيجابية CD45 هو عادة ما بين 25 إلى 35 أضعاف فوق مستويات الخلفية, تعريف باستخدام التحكم السلبي, المضادة للانكلوم المضادة للانثرة الخبيثة.كل عينة حليب الثدي هي فريدة من نوعها وبعض الكريات قد يكون من الصعب أن نرى. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مجموعات الكريات البيض، وبالتالي درجات ADCP، قد تختلف اختلافاً هائلاً من عينة إلى أخرى.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

عزل الكريات البيضاء من واجهة الإنسان الأم والجنين

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...