Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Vi takker Dr. Susan Zolla-Pazner i Department of Medicine og Department of Microbiology på Icahn School of Medicine på Mount Sinai for manuskript gennemgang. NIH/NICHD ydede støtte til dette projekt under tilskudsnummer R21 HD095772-01A1. Desuden blev R. Powell støttet af midler fra Department of Medicine, division af smitsomme sygdomme, Icahn School of Medicine på Mount Sinai.

Hver deltager i denne undersøgelse blev rekrutteret og interviewet i overensstemmelse med den etiske og institutionelle Review Board (IRB) godkendelse med vejledning og autorisation af Mount Sinai's program for beskyttelse af mennesker (PPHS) ved hjælp af en IRB-godkendt protokol for opnåelse af modermælk prøver.
1. klargøring af Target microsphere
<ol><li>Vælg et relevant målantigen. Bemærk: i dette eksempel blev det rekombinante protein V1V2-2...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk.">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li><li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons.">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring:+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth.">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li><li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals.">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li><li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding:+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer's+Patches+of+the+Nursed+Infant.">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).</li><li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates.">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).</li><li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants.">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries:+a+pooled+analysis.">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies.">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li><li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1.">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).</li><li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+(ADCC)+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality.">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li><li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1.">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li><li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody Fc. , (2014).</li><li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

Flowcytometry-baseret teknik til måling af ADCP-aktivitet beskrevet heri blev først beskrevet i 201130 og er siden blevet påvist robust og citeret i mere end 80 undersøgelser. Den protokol, der er beskrevet her, tilpasser denne teknik til brug med primære BM-celler for første gang. Tidligere undersøgelser af FC-medieret funktionalitet af BM-celler har været stort set begrænset til måling af oxidativ brister eller histologi-baserede fagocytose analyser ved hjælp af celler isoleret fra co...

Human modermælk (BM) består af moder celler, der er > 90% levedygtige1. Celle sammensætning er påvirket stærkt af fase af amning, sundhedsstatus af mor og spædbarn, og individuelle variation, som forbliver dårligt forstået1,2,3,4. I betragtning af, at BM indeholder ~ 103− 105 leukocytter/ml, det kan anslås, at ammede spædbørn indtager ~ 105− 108 maternel leukocytter dagligt5. Forskellige in vivo undersøgelser har vist, at maternel leukocytter give kritisk immunitet til spædbarnet og er funktionelle langt ud over disse steder af første indtagelse5,6,7,8 ,9,10,11. Alle maternelle afledte celler indtaget af spædbarnet har potentiale til at udføre immun funktioner sammen med eller for at kompensere for barnets egne leukocytter12.
Mor-til-barn transmission (MTCT) af humant immundefektvirus (HIV) er fortsat en krise i ressource-begrænset lande. Da diarré og luftvejssygdomme er ansvarlige for betydelige dødelighed blandt spædbørn i ressource begrænsede lande, og disse sygdomme er væsentligt reduceret ved eksklusiv amning, fordelene for HIV-inficerede mødre af amning langt opvejer risiciene13,14,15. Medmindre adgang til rent vand og passende modermælkserstatning er pålidelig, anbefaler WHO ikke ophør af amning for HIV-inficerede mødre16. Ca. 100.000 MTCTs via BM forekommer årligt; men kun ~ 15% af spædbørn ammet af deres HIV-inficerede mødre bliver smittet, hvilket tyder på en stærk beskyttende effekt af BM17,18,19,20,21. Talrige faktorer sandsynligvis arbejde i tandem for at forhindre transmission. Det er vigtigt, at hiv-specifikke antistoffer (ABS) i BM er korreleret med reduceret MTCT og/eller reduceret spædbarns død fra HIV-infektion22,23. Hvad der er stort set uklart er bidraget fra cellulær fraktion af BM til sine antivirale kvaliteter.
Mange ABS letter en række anti-virale aktiviteter medieret af den "konstante" region af immunglobulin molekyle, krystallizable fragment (FC), via interaktion med FC-receptorer (Fcr'er) fundet på stort set alle medfødte immunceller, stort set alle findes i human BM24. Antistofafhængig cellulær fagocytose (adcp) er blevet påvist som nødvendigt for clearance af virusinfektioner og er blevet undersøgt i tilfælde af forebyggelse af MTCT af hiv25,26,27, 28 , 29. i betragtning af den manglende viden om det potentielle bidrag af adcp aktivitet af BM fagocytter til forebyggelse af MTCT af hiv, vi har til formål at udvikle en stringent metode til at isolere celler fra Human BM for at gennemføre en undersøgelse af adcp medieret af celler fra BM opnået på forskellige stadier af amning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

Selv i fravær af antiretrovirale lægemidler, kun ~ 15% af spædbørn ammet af HIV-inficerede mødre bliver smittet, hvilket tyder på en stærk beskyttende effekt af modermælk (BM). Medmindre adgang til rent vand og passende modermælkserstatning er pålidelig, anbefaler WHO ikke ophør af amning for HIV-inficerede mødre. Talrige faktorer sandsynligvis arbejde i tandem for at reducere BM transmission. Ammede spædbørn indtager ~ 105− 108 maternel leukocytter dagligt, selv om det stadig er stort set uklart, er bidraget fra disse celler til de antivirale kvaliteter af BM. i øjeblikket har vi til formål at ISOLERE celler fra Human BM for at måle antistof-afhængige cellulære fagocytose (adcp), en af de mest essentielle og Pervasive medfødte immunrespons, af BM fagocytter mod hiv mål. Celler blev isoleret fra 5 humane BM-prøver opnået på forskellige stadier af amning. Isolering blev udført ved blid centrifugering efterfulgt af omhyggelig fjernelse af mælkefedt og gentagen vask af celle pellet. Fluorescerende perler belagt med hiv-kuvert (ENV) epitop blev anvendt som mål for analyse af adcp. Celler blev plettet med CD45 overflade markør til at identificere leukocytter. Det konstateredes, at ADCP-aktiviteten var signifikant over kontrol forsøgene og reproducerbart målbare ved hjælp af et HIV-specifikt antistof 830A.

Mælken kan opbevares ved stuetemperatur eller køligere (dog ikke frosset); men da vi har observeret nedsat levedygtighed, når mælken er blevet holdt meget kold (data ikke vist), og at det er enklere at indsamle, opbevare kort, og transport ved omgivelsestemperaturer, anbefales det, at prøverne ikke er nedkølet for at reducere variabilitet i stikprøver. I mælk opnået 7 − 183 dage efter partum varierede celle koncentrationen bestemt ved automatiseret celle tæller fra 16083 − 2...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Modermælk overfører humant immundefektvirus (HIV), men kun ~ 15% af spædbørn ammet af HIV-inficerede mødre bliver smittet. Ammede spædbørn indtager ~ 105− 108 maternel leukocytter dagligt, selv om disse celler er undersøgt. Her beskriver vi isolationen af brystmælk leukocytter og en analyse af deres fagocytiske kapacitet.

Isolering af leukocytter fra modermælken til brug i en antistofafhængig cellulær fagocytose analyse af HIV-mål

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Vi udviklede en streng metode til isolering af celler fra modermælk for at studere antistofafhængig cellulær fagocytose, eller ADCP, af modermælks fagocytter mod HIV-mål. Denne teknik letter den relativt hurtige og nemme isolering af modermælksceller til at vurdere kapaciteten af leukocyt populationer til at udføre ADCP. Demonstrationen af proceduren vil være Alisa Fox, en tekniker fra mit laboratorium.Når du har valgt et relevant målantigen, skal du bruge et kommercielt kit til at biotinylate det protein af interesse i henhold til producentens protokol. Og deponere den biotinylerede prøve i det øverste kammer af en spin kolonne. DER tilsættes PBS op til 400 mikroliter, og hætten skal sættes i, før du sætter kolonnen i et opsamlingsrør til centrifugering.Efter at strømmen er kasseret, tilsættes PBS til 400 mikroliter for endnu en centrifugering. Kassér strømmen igennem, tilsæt PBS til 400 mikroliter, og mål proteinkoncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer for at konjugere det biotinylerede protein til mikrometermikrosfærer. Inkuber seks mikrogram protein med 12 mikroliter af lagerperler i 200 mikroliter PBS pr. plade af konjugerede perler ved stuetemperatur i to timer, med blid vortexing hvert 20.Ved slutningen af inkubationen pellets proteinet konjugeret perler ved centrifugering og kassér supernatanten. Efter blid vortexing, resuspend proteinet i 1200 mikroliter på 0,1% BSA i PBS, og vask røret ved centrifugering to gange mere som netop påvist. Efter den sidste vask, resuspend pellet i 1200 mikroliter i PBS plus BSA.For at opsætte ADCP Assay Plader, først forberede 12 mikroliter fortyndinger af antistof, eller immun serum af interesse, i 2% BSA i PBS i en rund bund 96 brøndplade. Tilsæt 10 mikroliter af protein konjugerede perler pr. brønd til pladen i en to timers inkubation ved 37 grader Celsius. Ved inkubationens afslutning tilsættes 200 mikroliter PBS plus BSA.Efter at have fået modermælk fra raske diegivende kvinder, der udtrykker ved hjælp af en pumpe, adskilles mælkeindholdet ved centrifugering inden for fire timer efter ekspressionen ved centrifugering og hældes forsigtigt ud af skummetmælken og fedtet, så cellepillepellen ikke er forstyndet. Tør indersiden af røret af med en fnugfri tørre for at fjerne alt fedtet fra rørvæggen og tilsæt 10 milliliter PBS plus HSA. Opsplitning af pellet med blid pipettering for at undgå celleaktivering i apoptoseen, og overfør cellesuspensionen til et 15 milliliterrør til centrifugering.Efter endnu en vask i PBS plus HSA som netop påvist, skal cellerne forsigtigt opsbruges i en til to milliliter frisk PBS plus HSA til optælling. For en ADCP Assay, hurtigt vende den forberedte ADCP plade til at dekantere supernatant efter den endelige centrifugering og tilføje fem gange 10 på en fjerde frisk isoleret modermælk celler i 200 mikroliter af PBS plus BSA for en to timers inkubation ved 37 grader Celsius. Ved inkubationens afslutning centrifugeres cellerne og pillerne to gange i 200 mikroliter frisk PBS som påvist.Efter den sidste vask plettes cellerne med 0,5 mikrogram pr. milliliter fikserbar levedygtighedplet 450 pr. brønd i 50 mikroliter PBS i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning skal cellerne pellets i to vaskes i frisk PBS som påvist, og cellerne plettes for de leukocytmarkører af interesse i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning indsamles cellerne centrifugering, og cellerne vaskes to gange i 200 mikroliter på 1%BSA plus PBS pr. vask.Efter den sidste vask, fastgør pellets i 200 mikroliter på 0,5% formaldehyd per brønd i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. For flow cytometrisk analyse af celleprøver, indstille et flow cytometer udstyret med en høj-throughput pladelæser til at trække 175 mikroliter af prøve og til at indsamle 5000 celler per brønd. Udfør den indledende gating at fjerne doublets og snavs på en fremad scatter versus side scatter plot.Brug en side scatter versus levedygtighed plet plot til at fjerne de døde celler. Og bruge en side scatter versus CD45 plot til at differentiere de store leukocyt klasser. For alle CD45-positive celler eller for hver leukocyt-delmængde af interesse måles den antistofafhængige cellulære fagocytoseaktivitet ved at gating med en markør på perlespængecellerne i et histogram af den relevante fluorophorekanal for de konjugerede perler.Derefter beregnes den antistofafhængige cellulære fagocytosescore som medianen af fluorescensintensiteten af perlesp positiv celler med procentdelen af den samlede CD45 plus cellerne i den positive population. Her vises gating-strategien for eliminering af doublets, snavs og døde celler. Mellem en til 12% af de samlede levende celler er typisk CD45 positive leukocytter med de fleste af de påståede side scatter lav til mellemliggende CD45 lav monocytter synes at være prækursorer, eller at umodne celler, baseret på den side scatter versus CD45 gating.De påståede granulocytter defineres som side scatter høj, CD45 mellemliggende celler. Måling af ADCP-aktiviteten af friskisolerede modermælksceller ved hjælp af et HIV-specifikt humant monoklonalt antistof ved en måneds postpartum viser, at behandling med actinhæmmer Cytochalasin D og eller Fc-receptorblokerende antistoffer før inkubation med antistofbundet antigenkoblede perler resulterer i ADCP-aktiviteten på eller under den, der observeres ved tilstedeværelse af kontrolantistof. DEN ADCP-score, der bestemmes for de samlede CD45-positive celler, er normalt mellem 25 og 35 gange over baggrundsniveauerne, defineret ved hjælp af et negativt kontrol-, anti-miltbrand monoklonalt antistof.Hver modermælk prøve er unik, og nogle pellets kan være svært at se. Desuden kan leukocytpopulationerne og dermed ADCP-scorerne variere enormt fra prøve til prøve.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik og oxidativ Burst: Protokoller til isolering og Evaluering af humane leukocytter og blodplader

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering af leukocytter fra Human Maternal-føtal grænseflade

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering af leukocytter fra det murine væv på maternel-føtal grænseflade

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering af Exosomer fra plasma af HIV-1 Positive Personer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering af leukocytter fra musehud anvendelse af enzymatiske Digest og Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Anvendelse af en monocyt Monolayer Assay til Evaluer Fcy receptor-medieret fagocytose

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...