Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Nous remercions la Dre Susan Zolla-Pazner, du Département de médecine et de microbiologie de l'École de médecine Icahn du Mont Sinaï, pour son examen des manuscrits. Le NIH/NICHD a fourni du financement pour ce projet sous le numéro de subvention R21 HD095772-01A1. En outre, R. Powell a été soutenu par des fonds du Département de médecine, Division des maladies infectieuses, Icahn School of Medicine à Mount Sinai.

Chaque participant à cette étude a été recruté et interviewé en accord avec l'approbation de la Commission d'examen éthique et institutionnel (CISR) avec les directives et l'autorisation du Programme de protection des sujets humains (PPHS) approuvé par le Mont Sinaï à l'aide d'un protocole pour l'obtention d'échantillons de lait maternel.
1. Cibler la préparation de la microsphère
<ol><li>Sélectionnez un antigène cible pertinent. REMARQUE :...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk.">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li><li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons.">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring:+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth.">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li><li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals.">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li><li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding:+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer's+Patches+of+the+Nursed+Infant.">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).</li><li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates.">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).</li><li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants.">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries:+a+pooled+analysis.">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies.">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li><li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1.">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).</li><li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+(ADCC)+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality.">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li><li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1.">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li><li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody Fc. , (2014).</li><li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

La technique basée sur la cytométrie du débit pour mesurer l'activité ADCP décrite ci-dessus a été décrite pour la première fois en 201130 et a depuis fait ses preuves et a été citée dans plus de 80 études. Le protocole décrit ici adapte cette technique pour une utilisation avec des cellules BM primaires pour la première fois. Les études antérieures de la fonctionnalité fc-négociée par les cellules De MB ont été en grande partie limitées à la mesure des éclats oxydatifs ou...

Le lait maternel humain (BM) est composé de cellules maternelles qui sont viablesà 90% 1 . La composition cellulaire est fortement affectée par le stade de lactation, l'état de santé de la mère et du nourrisson, et la variation individuelle, qui reste mal comprise1,2,3,4. Étant donné que la BM contient 103à 105 leucocytes/mL, on peut estimer que les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour5. Diverses études in vivo ont démontré que les leucocytes maternels fournissent une immunité critique au nourrisson et sont fonctionnels bien au-delà de ces sites d'ingestion initiale5,6,7,7 ,9,10,11. Toutes les cellules d'origine maternelle ingérées par le nourrisson ont le potentiel d'effectuer des fonctions immunitaires à côté ou de compenser les leucocytes12.
La transmission mère-enfant (TMT) du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste une crise dans les pays à ressources limitées. Étant donné que les maladies diarrhéiques et respiratoires sont responsables de taux de mortalité importants chez les nourrissons dans les pays à ressources limitées, et que ces maladies sont considérablement réduites par l'allaitement exclusif, les avantages pour les mères infectées par le VIH l'allaitement maternel l'emporte de loin sur les risques13,14,15. À moins que l'accès à de l'eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l'OMS ne recommande pas l'arrêt de l'allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH16. Environ 100 000 MTT par l'intermédiaire de BM se produisent annuellement ; pourtant, seulement 15 % des nourrissons allaités par leur mère infectée par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur de la BM17,18,19,20,21. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour prévenir la transmission. Fait important, les anticorps spécifiques au VIH (Abs) dans le BM ont été corrélés avec une réduction du MTCT et/ou une réduction de la mortalité infantile par infection par le VIH22,23. Ce qui reste largement flou est la contribution de la fraction cellulaire de BM à ses qualités antivirales.
Beaucoup d'Abs facilitent une variété d'activités antivirales médiées par la région « constante » de la molécule d'immunoglobuline, le fragment cristallin (Fc), par l'intermédiaire de l'interaction avec des récepteurs de Fc (FcRs) trouvés sur pratiquement toutes les cellules immunitaires innées, pratiquement toutes qui se trouvent dans l'humain BM24. La phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP) a été démontrée comme nécessaire pour le dégagement des infections virales et a été sous-étudiée dans le cas de la prévention du MTCT du VIH25,26,27, 28 Annonces , 29. Étant donné le manque de connaissances sur la contribution potentielle de l'activité ADCP par les phagocytes BM à la prévention du TMT du VIH, nous avons cherché à mettre au point une méthode rigoureuse pour isoler les cellules de la BM humaine afin d'entreprendre une étude de l'ADCP BM obtenu à divers stades de lactation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
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isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

Même en l'absence de médicaments antirétroviraux, seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur du lait maternel (BM). À moins que l'accès à de l'eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l'OMS ne recommande pas l'arrêt de l'allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour réduire la transmission de La BM. Les nourrissons allaités ingèrent par jour 105à 108 leucocytes maternels, bien que ce qui reste largement incertain, c'est la contribution de ces cellules aux qualités antivirales de la BM. Actuellement, nous avons cherché à isoler les cellules de la BM humaine afin de mesurer phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l'une des réponses immunitaires innées les plus essentielles et les plus répandues, par les phagocytes BM contre les cibles du VIH. Des cellules ont été isolées de 5 échantillons humains de BM obtenus à divers stades de lactation. L'isolement a été effectué par centrifugation douce suivie d'une élimination soigneuse de la graisse de lait et le lavage répété de la pastille cellulaire. Les perles fluorescentes recouvertes d'épitope de l'enveloppe du VIH (Env) ont été utilisées comme cibles pour l'analyse du PCAA. Des cellules ont été souillées avec le marqueur de surface CD45 pour identifier des leucocytes. On a constaté que l'activité de l'ADCP était significative au-dessus des expériences de contrôle et reproductiblement mesurable à l'aide d'un anticorps spécifique au VIH 830A.

Le lait peut être conservé à température ambiante ou plus frais (mais non congelé); cependant, étant donné que nous avons observé une viabilité réduite lorsque le lait a été gardé très froid (données non montrées), et qu'il est plus simple de recueillir, de stocker brièvement et de transporter à des températures ambiantes, il est recommandé que les échantillons ne soient pas réfrigérés afin de réduire variabilité d'échantillon à échantillon. Dans le lait obten...

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Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Le lait maternel transmet le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), bien que seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH soient infectés. Les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour, bien que ces cellules soient sous-étudiées. Ici nous décrivons l'isolement des leucocytes de lait maternel et une analyse de leur capacité phagocytic.

Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Nous avons mis au point une méthode rigoureuse pour isoler les cellules du lait maternel humain afin d’étudier la phagocytose cellulaire dépendante des anticorps, ou ADCP, par phagocytes de lait maternel contre les cibles du VIH. Cette technique facilite l’isolement relativement rapide et facile des cellules du lait maternel afin d’évaluer la capacité des populations de leucocytes à effectuer l’ADCP. Alisa Fox, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure.Après avoir sélectionné un antigène cible pertinent, utilisez un kit commercial pour biotinylate la protéine d’intérêt selon le protocole du fabricant. Et déposez l’échantillon biotinylé dans la chambre haute d’une colonne de spin. Ajouter pbs jusqu’à 400 microlitres et capuchon de la chambre avant d’insérer la colonne dans un tube de collecte pour centrifugation.Après avoir jeté le flux à travers, ajouter PBS à 400 microlitres pour une deuxième centrifugation. Jetez le flux à travers, ajouter PBS à 400 microlitres, et mesurer la concentration de protéines par un spectrophotomètre pour conjuguer la protéine biotinylated aux microsphériques micromètres. Incuber six microgrammes de protéines avec 12 microlitres de perles de stock dans 200 microlitres de PBS par plaque de perles conjuguées à température ambiante pendant deux heures, avec vortex doux toutes les 20 minutes.À la fin de l’incubation, granuler les perles conjuguées par centrifugation et jeter le supernatant. Après un léger vortex, resuspendez la protéine en 1200 microlitres de 0,1%BSA dans PBS, et lavez le tube par centrifugation deux fois de plus comme cela vient de le démontrer. Après le dernier lavage, resuspendez la pastille en 1200 microlitres dans PBS plus BSA.Pour mettre en place des plaques d’analyse ADCP, préparez d’abord 12 dilutions microlitres d’anticorps, ou le sérum immunitaire d’intérêt, dans 2%BSA dans PBS dans une plaque ronde de puits de 96 bas. Ajouter 10 microlitres de perles conjuguées par puits à l’assiette pendant une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter 200 microlitres de PBS plus BSA.Après avoir obtenu du lait maternel humain auprès de femmes allaitantes en bonne santé exprimant à l’aide d’une pompe, dans les quatre heures suivant l’expression séparer le contenu du lait par centrifugation et verser soigneusement le lait écrémé et la graisse, laissant la pastille cellulaire intacte. Essuyer l’intérieur du tube avec un lingette sans peluche pour enlever toute la graisse de la paroi du tube et ajouter 10 millilitres de PBS plus HSA. Resuspendez la pastille avec un tuyautage doux pour éviter l’activation cellulaire dans l’apoptose, et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation.Après un deuxième lavage dans PBS plus HSA comme juste démontré, résuspendez doucement les cellules dans un à deux millilitres de PBS frais plus HSA pour compter. Pour un essai ADCP, inversez rapidement la plaque ADCP préparée pour décanter le supernatant après la centrifugation finale et ajoutez cinq fois 10 à une quatrième cellule de lait maternel fraîchement isolée dans 200 microlitres de PBS plus BSA pour une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, centrifuger les cellules et laver les granulés deux fois dans 200 microlitres de PBS frais comme démontré.Après le dernier lavage, tacher les cellules avec 0,5 microgramme par millilitre de tache fixable de viabilité 450 par puits dans 50 microlitres de PBS pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, pelleter les cellules pendant deux lavages dans pbs frais comme démontré, et tacher les cellules pour les marqueurs leucocytes d’intérêt pendant 30 minutes à température ambiante, protégé de la lumière. À la fin de l’incubation, recueillir la centrifugation des cellules, et laver les cellules deux fois dans 200 microlitres de 1%BSA plus PBS par lavage.Après le dernier lavage, fixer les granulés dans 200 microlitres de 0,5% de formaldéhyde par puits pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Pour l’analyse cytométrique de flux des échantillons de cellules, réglez un cytomètre d’écoulement équipé d’un lecteur de plaque à haut débit pour retirer 175 microlitres d’échantillon et recueillir 5000 cellules par puits. Effectuez le gating initial pour éliminer les doublets et les débris sur une parcelle de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle de dispersion latérale.Utilisez une parcelle de tache de dispersion latérale par rapport à la viabilité pour éliminer les cellules mortes. Et utilisez une parcelle latérale scatter versus CD45 pour différencier les principales classes de leucocytes. Pour toutes les cellules positives CD45, ou pour chaque sous-ensemble de leucocytes d’intérêt, mesurez l’activité de phagocytose cellulaire dépendante de l’anticorps en çant avec un marqueur sur les cellules positives de perle dans un histogramme du canal fluorophore approprié pour les perles conjuguées.Calculez ensuite les scores de phagocytose cellulaire dépendante de l’anticorps comme médiane de l’intensité de fluorescence des cellules positives de perle par le pourcentage du CD45 total plus les cellules dans la population positive. Ici, la stratégie de gating pour éliminer des doublets, des débris, et des cellules mortes est montrée. Entre un et 12 % du total des cellules vivantes sont généralement des leucocytes positifs CD45, la plupart des prétendus ltéraux se dispersant faiblement à intermédiaire CD45 faibles monocytes semblant être des précurseurs, ou à des cellules immatures, basées sur la dispersion latérale par rapport au Gating CD45.Les prétendus granulocytes sont définis comme des cellules intermédiaires CD45 de dispersion latérale élevée. La mesure de l’activité ADCP des cellules du lait maternel fraîchement isolées à l’aide d’un anticorps monoclonal humain spécifique au VIH à un mois après le départ révèle que le traitement par inhibiteur de l’actine Cytochalasine D et ou récepteur Fc bloquant les anticorps avant l’incubation avec des perles couplées liées à l’anticorps entraîne une activité ADCP à ou en dessous de celle observée en présence d’anticorps témoins. Le score ADCP déterminé pour le total des cellules positives CD45 est généralement entre 25 et 35 fois au-dessus des niveaux de fond, défini à l’aide d’un contrôle négatif, anticorps monoclonal anti-anthrax.Chaque échantillon de lait maternel est unique et certaines granulés peuvent être difficiles à voir. En outre, les populations de leucocytes, et donc les scores ADCP, peuvent varier énormément d’un échantillon à l’autre.

Research

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Immunology and Infection

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