Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Wir danken Dr. Susan Zolla-Pazner in der Abteilung für Medizin und Abteilung für Mikrobiologie an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai für die Manuskriptüberprüfung. Das NIH/NICHD stellte Mittel für dieses Projekt unter der Fördernummer R21 HD095772-01A1 bereit. Darüber hinaus wurde R. Powell durch Mittel des Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine am Mount Sinai unterstützt.

Jeder Teilnehmer an dieser Studie wurde in Übereinstimmung mit der Zustimmung des Ethik- und Institutionellen Prüfungsausschusses (IRB) mit der Anleitung und Genehmigung des Mount Sinai Program for the Protection of Human Subjects (PPHS) unter Verwendung eines Von IRB zugelassenen Programms für menschliche Subjekte (PPHS) rekrutiert und interviewt. für die Gewinnung von Muttermilchproben.
1. Ziel Mikrosphäre nerische Vorbereitung
<ol><li>Wählen Sie ei...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk.">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li><li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons.">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring:+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth.">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li><li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals.">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li><li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding:+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer's+Patches+of+the+Nursed+Infant.">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).</li><li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates.">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).</li><li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants.">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries:+a+pooled+analysis.">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies.">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li><li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1.">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).</li><li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+(ADCC)+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality.">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li><li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1.">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li><li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody Fc. , (2014).</li><li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

Die hier beschriebene Strömungszytometrie-basierte Technik zur Messung der ADCP-Aktivität wurde erstmals 201130 beschrieben und hat sich seitdem als robust erwiesen und in mehr als 80 Studien zitiert. Das hier beschriebene Protokoll passt diese Technik erstmals für die Verwendung mit primären BM-Zellen an. Frühere Studien über die Fc-vermittelte Funktionalität durch BM-Zellen beschränkten sich weitgehend auf die Messung oxidativer Ausbrüche oder histologiebasierte Phagozytose-Assays mit Z...

Muttermilch (BM) besteht aus mütterlichen Zellen, die >90% lebensfähig sind1. Die Zellzusammensetzung wird stark durch das Stadium der Stillzeit, den Gesundheitszustand von Mutter und Kind und die individuelle Variation beeinflusst, die nach wie vor wenig verstanden wird1,2,3,4. Da BM 103€105 Leukozyten/ml enthält, kann geschätzt werden, dass gestillte Säuglinge täglich 105x 108 mütterliche Leukozyteneinnehmen. Verschiedene In-vivo-Studien haben gezeigt, dass mütterliche Leukozyten dem Säugling eine kritische Immunität bieten und weit über diese Orte der Erstaufnahme hinaus funktionieren5,6,7,8 ,9,10,11. Alle mütterlich abgeleiteten Zellen, die vom Säugling aufgenommen werden, haben das Potenzial, Nebenfunktionen neben dem Säugling samt Leukozyten auszuführen oder zu kompensieren12.
Die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) bleibt in ressourcenbegrenzten Ländern eine Krise. Da Durchfall- und Atemwegserkrankungen für eine erhebliche Sterblichkeitsrate bei Säuglingen in ressourcenbegrenzten Ländern verantwortlich sind und diese Krankheiten durch exklusives Stillen deutlich reduziert werden, sind die Vorteile für HIV-infizierte Mütter von Stillen weit überwiegt die Risiken13,14,15. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter16keine Einstellung des Stillens. Jährlich treten ca. 100.000 MTCTs über BM auf; doch, nur 15% der Säuglinge gestillt von ihren HIV-infizierten Müttern infiziert, was auf eine starke Schutzwirkung von BM17,18,19,20,21. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich im Tandem, um eine Übertragung zu verhindern. Wichtig ist, dass HIV-spezifische Antikörper (Abs) in BM mit reduziertem MTCT und/oder reduziertem Tod von Säuglingen durch HIV-Infektion korreliert wurden22,23. Weitgehend unklar bleibt der Beitrag des zellulären Anteils von BM zu seinen antiviralen Qualitäten.
Viele Abs ermöglichen eine Vielzahl antiviraler Aktivitäten, die durch die "konstante" Region des Immunglobulinmoleküls, das kristallisierbare Fragment (Fc), über die Interaktion mit Fc-Rezeptoren (FcRs) vermittelt werden, die auf praktisch allen angeborenen Immunzellen gefunden werden, von denen praktisch alle finden sie in human BM24. Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) wurde als notwendig für die Clearance von Virusinfektionen nachgewiesen und im Falle der Prävention von MTCT von HIV25,26,27, 28 , 29. Angesichts des Mangels an Wissen über den potenziellen Beitrag der ADCP-Aktivität durch BM-Phagozyten zur Prävention von MTCT von HIV, wollten wir eine strenge Methode entwickeln, um Zellen aus menschlichen BM zu isolieren, um eine Studie über ADCP durchzuführen, die von Zellen aus BM in verschiedenen Stadien der Laktation erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

Selbst in Ermangelung antiretroviraler Medikamente werden nur 15 % der Säuglinge infiziert, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, was auf eine starke schützende Wirkung der Muttermilch (BM) hindeutet. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter keine Einstellung des Stillens. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich zusammen, um die BM-Übertragung zu reduzieren. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, was jedoch weitgehend unklar bleibt, ist der Beitrag dieser Zellen zu den antiviralen Qualitäten von BM. Antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP), eine der essentiellen und durchdringendsten angeborenen Immunantworten, durch BM-Phagozyten gegen HIV-Ziele. Die Zellen wurden aus 5 menschlichen BM-Proben isoliert, die in verschiedenen Stadien der Laktation gewonnen wurden. Die Isolierung erfolgte durch sanfte Zentrifugation, gefolgt von einer sorgfältigen Entfernung von Milchfett und wiederholtem Waschen des Zellpellets. Fluoreszierende Perlen, die mit DEM Epitop hiv-hüllt waren, wurden als Ziele für die Analyse von ADCP verwendet. Die Zellen wurden mit dem CD45-Oberflächenmarker befleckt, um Leukozyten zu identifizieren. Es wurde festgestellt, dass die ADCP-Aktivität über Kontrollexperimenten signifikant war und reproduzierbar mit einem HIV-spezifischen Antikörper 830A messbar war.

Milch kann bei Raumtemperatur oder kühler (wenn auch nicht gefroren) aufbewahrt werden; Da wir jedoch eine verminderte Lebensfähigkeit beobachtet haben, wenn Milch sehr kalt gehalten wurde (Daten nicht gezeigt), und dass es einfacher ist, kurz zu sammeln, zu lagern und bei Umgebungstemperaturen zu transportieren, wird empfohlen, Proben nicht zu kühlen, um Beispiel-zu-Probe-Variabilität. In Milch, die 7 bis 183 Tage nach der Partumato erhalten wurde, lag die durch den automatisierten Z...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Muttermilch überträgt das humane Immundefizienzvirus (HIV), obwohl sich nur 15 % der säuglingsgestillten Säuglinge, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, anstecken. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, obwohl diese Zellen unteruntersucht sind. Hier beschreiben wir die Isolierung von Muttermilchleukozyten und eine Analyse ihrer phagozytischen Kapazität.

Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Wir haben eine strenge Methode zur Isolierung von Zellen aus der Muttermilch entwickelt, um antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) durch Muttermilchphagozyten gegen HIV-Ziele zu untersuchen. Diese Technik erleichtert die relativ schnelle und einfache Isolierung von Muttermilchzellen, um die Fähigkeit von Leukozytenpopulationen zur Durchführung von ADCP zu bewerten. Demonstriert wird das Verfahren von Alisa Fox, einer Technikerin aus meinem Labor.Nach der Auswahl eines relevanten Zielantigens verwenden Sie ein kommerzielles Kit, um das Protein von Interesse gemäß dem Herstellerprotokoll zu biotinyn. Und legen Sie die biotinylierte Probe in die obere Kammer einer Spinsäule. Fügen Sie PBS bis zu 400 Mikroliter hinzu und verschließen Sie die Kammer, bevor Sie die Säule zur Zentrifugierung in ein Sammelrohr einsetzen.Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, fügen Sie PBS zu 400 Mikrolitern für eine zweite Zentrifugation hinzu. Entsorgen Sie den Durchfluss, fügen Sie PBS zu 400 Mikroliterhinzulierung hinzu und messen Sie die Proteinkonzentration durch ein Spektralphotometer, um das biotinylierte Protein zu Mikrometer-Mikrosphären zu konjugieren. Inkubieren Sie sechs Mikrogramm Protein mit 12 Mikroliter n. B. Stockperlen in 200 Mikroliter PBS pro Platte konjugierter Perlen bei Raumtemperatur für zwei Stunden, wobei alle 20 Minuten sanft wirbelt.Am Ende der Inkubation, Pellet das Protein konjugierte Perlen durch Zentrifugation und entsorgen sie den Überstand. Nach sanftem Wirbeln das Protein in 1200 Mikrolitern 0,1%BSA in PBS wieder aufsetzen und das Rohr durch Zentrifugation noch zwei Mal waschen, wie gerade gezeigt. Nach der letzten Wäsche das Pellet in 1200 Mikrolitern in PBS plus BSA wieder aufsetzen.Um ADCP Assay Plates einzurichten, bereiten Sie zunächst 12 Mikroliter-Verdünnungen von Antikörpern oder dem Immunserum von Interesse in 2%BSA in PBS in einer runden unteren 96-Wellplatte vor. Fügen Sie 10 Mikroliter Protein konjugierte Perlen pro Brunnen auf den Teller für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation 200 Mikroliter PBS plus BSA hinzufügen.Nach der Gewinnung von Muttermilch von gesunden laktierenden Frauen, die mit einer Pumpe ausdrücken, trennen Sie innerhalb von vier Stunden nach dem Ausdruck den Milchgehalt durch Zentrifugation und gießen Sie vorsichtig die Magermilch und das Fett ab, so dass das Zellpellet ungestört bleibt. Wischen Sie die Innenseite des Rohres mit einem fusselfreien Wisch, um das gesamte Fett aus der Rohrwand zu entfernen und 10 Milliliter PBS plus HSA hinzuzufügen. Setzen Sie das Pellet mit sanfter Pipettierung aus, um eine Zellaktivierung in der Apoptose zu vermeiden, und übertragen Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Rohr.Nach einer zweiten Wäsche in PBS plus HSA, wie gerade gezeigt, setzen Sie die Zellen vorsichtig in ein bis zwei Milliliter frische PBS plus HSA zum Zählen wieder ab. Für einen ADCP-Assay die vorbereitete ADCP-Platte schnell umkehren, um den Überstand nach der letzten Zentrifugation zu dekantieren und fünfmal 10 an einer vierten frisch isolierten Muttermilchzelle in 200 Mikroliter PBS plus BSA für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Zellen und waschen Sie die Pellets zweimal in 200 Mikroliter frischer PBS, wie gezeigt.Nach der letzten Wäsche, färben die Zellen mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter fixierbare Lebensfähigkeit Fleck 450 pro Brunnen in 50 Mikroliter PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation pellet die Zellen für zwei Waschungen in frischem PBS, wie gezeigt, und färben die Zellen für die Leukozytenmarker von Interesse für 30 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht. Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die Zellen Zentrifugation, und waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikroliter von 1%BSA plus PBS pro Wäsche.Nach der letzten Wäsche die Pellets in 200 Mikroliter mit 0,5% Formaldehyd pro Brunnen 30 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, fixieren. Für die zytometrische Durchflussanalyse der Zellproben, stellen Sie ein Durchflusszytometer mit einem Hochdurchsatz-Plattenleser, um 175 Mikroliter Proben zurückzuziehen und 5000 Zellen pro Bohrkörper zu sammeln. Führen Sie das anfängliche Gating aus, um Doublets und Trümmer auf einem Vorwärtsstreuungs- oder Seitenstreuungsdiagramm zu beseitigen.Verwenden Sie ein Seitenstreuungs-/Lebensfähigkeits-Fleckendiagramm, um die abgestorbenen Zellen zu beseitigen. Und verwenden Sie eine Seitenstreuung im Vergleich zu CD45-Plot, um die wichtigsten Leukozytenklassen zu unterscheiden. Für alle CD45-positiven Zellen oder für jede Vonbiot-Untermenge messen Sie die antikörperabhängige zelluläre Phagozytoseaktivität, indem sie mit einem Marker auf die Adad-positiven Zellen in einem Histogramm des entsprechenden Fluorophorkanals für die konjugierten Perlen gegating.Berechnen Sie dann die Antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Werte als Median der Fluoreszenzintensität der Ad-positiven Zellen um den Prozentsatz der gesamten CD45 plus die Zellen in der positiven Population. Hier wird die Gating-Strategie zur Beseitigung von Doublets, Schutt und abgestorbenen Zellen gezeigt. Zwischen einem bis 12% aller lebenden Zellen sind in der Regel CD45-positive Leukozyten, wobei die meisten der angeblichen Seitenstreuung niedrig bis zwischen CD45 niedrige Monozyten scheinen Vorläufer zu sein, oder unreife Zellen, basierend auf der Seitenstreuung im Vergleich ZU CD45 Gating.Die angeblichen Granulozyten werden als Side Scatter high, CD45 Zwischenzellen definiert. Die Messung der ADCP-Aktivität frisch isolierter Muttermilchzellen mit einem HIV-spezifischen humanen monoklonalen Antikörper nach einem Monat nach der Partikation zeigt, dass die Behandlung mit Actin-Hemmer Cytochalasin D und oder Fc-Rezeptor-blockierenden Antikörpern vor der Inkubation mit Antikörper gebundenen Antigen-gekoppelten Perlen zu der ADCP-Aktivität führt, die in Gegenwart von Kontrollantikörpern beobachtet wurde. Der ADCP-Score, der für insgesamt CD45-positive Zellen ermittelt wird, liegt in der Regel zwischen 25 und 35 Mal über den Hintergrundniveaus, definiert mit einem negativen Kontroll-, Anti-Anthrax-Monoklon-Antikörper.Jede Muttermilchprobe ist einzigartig und einige Pellets können schwer zu sehen sein. Darüber hinaus können die Leukozytenpopulationen und damit die ADCP-Werte von Probe zu Probe sehr unterschiedlich sein.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...