Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

אנו מודים לד ר סוזאן זוללה-פזנר במחלקה לרפואה ומחלקת מיקרוביולוגיה בבית הספר לרפואה ע שלמה בהר סיני לסקירה כתבי יד. NIH/ניקולה סיפק מימון לפרויקט זה תחת המענק מספר R21 HD095772-01A1. בנוסף, היתה למשרד המחלקה לרפואה מחלקת מחלות זיהומיות, בית הספר לרפואה ע ר Icahn בהר סיני.

כל משתתף במחקר זה גויס והתראיין בהסכמה עם לוחות הביקורת האתית והמוסדית (IRB) עם ההדרכה והאישור של התוכנית של הר סיני להגנה על נושאים אנושיים (PPHS) באמצעות IRB מאושר פרוטוקול לקבלת דגימות חלב השד.
1. הכנה למיקרוספירה
<ol><li>בחר אנטיגן יעד רלבנטי. הערה: בדוגמה זו, ...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk.">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li><li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons.">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring:+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth.">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li><li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals.">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li><li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding:+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer's+Patches+of+the+Nursed+Infant.">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).</li><li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates.">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).</li><li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants.">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries:+a+pooled+analysis.">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies.">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li><li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1.">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).</li><li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+(ADCC)+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality.">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li><li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1.">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li><li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody Fc. , (2014).</li><li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

את הטכניקה מבוססי הזרימה cy, למדידת פעילות ADCP שתוארה לעיל תוארה לראשונה ב 201130 , מאז הוכח חזק מצוטט ביותר מ 80 לימודים. הפרוטוקול המתואר כאן מתאים את הטכניקה לשימוש עם תאי BM ראשיים בפעם הראשונה. המחקרים הקודמים של Fc-בתיווך פונקציונליות על ידי התאים BM היו מוגבלים במידה רבה למדידה ש?...

חלב האדם (BM) מורכב של תאים אמהי כי הם > 90% קיימא1. הרכב התא מושפע באופן חזק על ידי שלב של הנקה, מעמד הבריאות של האם והתינוק, וריאציה אינדיבידואלית, אשר נשאר מובן בצורה גרועה1,2,3,4. בהינתן כי מוניטור מכיל ~ 103על 105 לוקיציטים/mL, זה יכול להיות מוערך כי תינוקות החזה לבלוע ~ 105על 10שמונה לוקיולוציטים היומי5. שונים במחקרים vivo הוכיחו כי לוקיציטים אימהי לספק חסינות קריטית לתינוק והם פונקציונליים היטב מעבר לאתרים אלה של בליעה ראשונית5,6,7,8 ,9,10,11. כל התאים הmaternally שבלע התינוק יש את הפוטנציאל לבצע פונקציות החיסון לצד או לפצות על לוקיציטים של התינוק12.
העברת אמא אל הילד (MTCT) של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נשאר משבר במדינות מוגבלות משאבים. כdiarrheal ומחלות הנשימה אחראים לשיעורי התמותה הניכרים בקרב תינוקות במדינות מוגבלות משאבים, ומחלות אלה מופחתות באופן משמעותי על ידי הנקה בלעדית, את היתרונות לאמהות הנגועות באיידס של הנקה הרבה עולה על הסיכונים13,14,15. אלא אם כן הגישה למים נקיים ונוסחת התינוק המתאימה היא אמינה, האדם אינו ממליץ על הפסקת ההנקה לאמהות הנגועות באיידס16. כ 100,000 בקירוב באמצעות BM מתרחשים מדי שנה; עם זאת, רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי האמהות שלהם הנגועים באיידס להידבק, מציע אפקט הגנה חזקה של BM17,18,19,20,21. גורמים רבים נוטים לעבוד במשולב כדי למנוע שידור. חשוב מכך, נוגדנים ספציפיים ל-HIV (Abs) ב-BM יש קורלציה עם mtct מופחת ו/או מופחת תינוק מוות מזיהום HIV22,23. מה שנשאר בלתי ברור הוא התרומה של החלק הסלולרי של BM לאיכויות האנטי ויראליות שלה.
Abs רבים להקל על מגוון של פעילויות אנטי ויראליות בתיווך על ידי האזור ' קבוע ' של מולקולה האימונוגלובולין, הקטע crystallizable (Fc), באמצעות אינטראקציה עם קולטני Fc (FcRs) נמצא על כמעט כל התאים החיסוניים מולדים, כמעט כל אשר נמצאים האדם BM24. נוגדן תלויי תאי הסלולר (adcp) כבר הוכח כנדרש עבור הסיווג של זיהומים ויראלי כבר למדו במקרה של מניעת mtct של HIV25,26,27, מיכל בן 28 , 29. בהינתן דלות של הידע על התרומה הפוטנציאלית של פעילות adcp על ידי BM phagocytes למניעת mtct של HIV, אנחנו כיוונו לפתח שיטה קפדנית לבודד תאים מתוך מוניטור אנושי על מנת לבצע מחקר של adcp מתווכת על ידי תאים מ BM התקבל בשלבים שונים של הנקה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

גם בהעדר תרופות אנטי-ויראליות, רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי אמהות שנדבקו ב-HIV להידבק, מציע השפעה הגנה חזקה של חלב (BM). אלא אם כן הגישה למים נקיים ונוסחת התינוק המתאימה אמינה, האדם אינו ממליץ על הפסקת ההנקה לאמהות הנגועות באיידס. גורמים רבים נוטים לעבוד במקביל כדי להפחית את השידור BM. תינוקות החושן לבלוע ~ 105על 108 שמונה לוקיציטים היומיום, למרות מה שנשאר ברור במידה רבה הוא התרומה של תאים אלה לאיכויות האנטי ויראליות של BM. כעת כיוונו לבודד תאים מתוך מוניטור האדם כדי למדוד נוגדן תלוי phagocyציטוזה הסלולר (ADCP), אחד התגובות החיוניות ביותר ומחוצה המערכת החיסונית, על ידי BM phagocytes נגד מטרות HIV. תאים היו מבודדים 5 האדם דגימות BM התקבל בשלבים שונים של ההנקה. בידוד נעשה באמצעות צנטריפוגה עדין ואחריו הסרה זהירה של שומן חלב ושטיפת חוזר של הגלולה התא. חרוזים פלורסנט מצופה מעטפת HIV (Env) אפירופה שימשו כמטרות ניתוח של ADCP. תאים היו מוכתמים עם סמן פני השטח CD45 כדי לזהות את הלוקוציטים. נמצא כי הפעילות ADCP היה משמעותי מעל ניסויים בקרה ומדידה הנידובית באמצעות נוגדן ספציפי HIV 830A.

ניתן לשמור על חלב בטמפרטורת החדר או קריר יותר (אם כי לא קפוא); עם זאת, בהתחשב בכך שבחנו בכדאיות מופחתת כאשר החלב נשמר קר מאוד (הנתונים לא מוצגים), וכי זה פשוט לאסוף, לאחסן בקצרה, ותחבורה בטמפרטורות הסביבה, מומלץ כי דגימות לא מקורר כדי להקטין את שינויים מדגם לדוגמה. בחלב שהושג ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

חלב אם מעביר וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), אם כי רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי אמהות מזוהמת HIV להידבק. תינוקות החושן לבלוע ~ 105על 10שמונה לוקיציטים אימהי מדי יום, למרות תאים אלה אינם לומדים. כאן אנו מתארים את הבידוד של חלב לוקיולוציטים וניתוח של קיבולת phagocytic שלהם.

בידוד של לוקיולוציטים מחלב השד האנושי לשימוש בנוגדן-מותנה תאית הסלולר שיטת מטרות HIV

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

פיתחנו שיטה קפדנית לבודד תאים מחלב אם אנושי כדי לחקור phagocytosis הסלולר תלוי נוגדנים, או ADCP, על ידי phagocytes חלב אם נגד מטרות HIV. טכניקה זו מקלה על בידוד מהיר וקל יחסית של תאי חלב אם כדי להעריך את היכולת של אוכלוסיות לויוציט לבצע ADCP. הדגימה של ההליך תהיה אליסה פוקס, טכנאית מהמעבדה שלי.לאחר בחירת אנטיגן יעד רלוונטי, השתמש בערכה מסחרית כדי להפוך את החלבון לעניין על פי פרוטוקול היצרן. ולהפקיד את הדגימה biotinylated לתא העליון של עמוד ספין. מוסיפים PBS עד 400 מיקרוליטרים ומכסים את התא לפני הכנסת העמודה לצינור איסוף לצנטריפוגה.לאחר השלכת הזרימה דרך, להוסיף PBS ל 400 microliters עבור צנטריפוגה שנייה. השלך את הזרימה דרך, להוסיף PBS ל 400 microliters, ולמדוד את ריכוז החלבון על ידי ספקטרופוטומטר כדי להצטיין את החלבון biotinylated מיקרומטר מיקרוספרות. הדגירה שישה מיקרוגרם של חלבון עם 12 microliters של חטיף מלאי ב 200 microliters של PBS לכל צלחת של חרוזים נדדים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים, עם מערבולת עדינה כל 20 דקות.בסוף הדגירה, גלולה את החלבון חרוזים גדוש על ידי צנטריפוגה להשליך את supernatant. לאחר מערבולת עדינה, יש להתריע מחדש על החלבון ב-1200 מיקרוליטרים של 0.1%BSA ב-PBS, ולשטוף את הצינור על ידי צנטריפוגה פעמיים נוספות כפי שהודגם זה בלבד. לאחר הכביסה האחרונה, יש לעשות שימוש חוזר ב-1200 מיקרוליטרים ב-PBS פלוס BSA.כדי להקים צלחות ADCP Assay, הכינו תחילה 12 דילול מיקרוליטר של נוגדנים, או את הנסיוב החיסוני המעניין, ב-2%BSA ב-PBS בצלחת עגולה תחתונה של 96 בארות. מוסיפים לצלחת 10 מיקרוליטרים של חרוזים נקובים בחלבון למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להוסיף 200 microliters של PBS בתוספת BSA.לאחר קבלת חלב אם אנושי מנשים מניקות בריאות המביעות באמצעות משאבה, בתוך ארבע שעות של ביטוי להפריד את תכולת החלב על ידי צנטריפוגה בזהירות לשפוך את חלב דל שומן ושומן, משאיר את גלולת התא באין מפריע. לנגב את החלק הפנימי של הצינור עם לנגב ללא מוך כדי להסיר את כל השומן מקיר הצינור ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS בתוספת HSA. תן את גלולה עם צינור עדין כדי למנוע הפעלת תאים באפופטוזיס, ולהעביר את ההשעיה התא צינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה.לאחר שטיפה שנייה ב- PBS בתוספת HSA כפי שהודגם זה הרגע, יש לעכל בעדינות את התאים באחד עד שני מיליליטר של PBS טרי בתוספת HSA לספירה. עבור ADCP Assay, במהירות להפוך את צלחת ADCP מוכן כדי decant supernatant לאחר הצנטריפוגה הסופית ולהוסיף חמש פעמים 10 בתאי חלב אם מבודדים טריים הרביעי ב 200 microliters של PBS בתוספת BSA עבור דגירה של שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, צנטריפוגה התאים לשטוף את כדורי פעמיים 200 microliters של PBS טרי כפי שהוכח.לאחר הכביסה האחרונה, להכתים את התאים עם 0.5 מיקרוגרם למיליליטר של כתם הכדאיות לתיקון 450 ל באר ב 50 microliters של PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, גלולה את התאים עבור שתי שטיפות PBS טרי כפי שהודגם, ולהכתים את התאים עבור סמני לויוציט עניין במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים צנטריפוגה, ולשטוף את התאים פעמיים 200 microliters של 1%BSA בתוספת PBS לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, לתקן את כדורי 200 microliters של 0.5% פורמלדהיד לכל באר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לניתוח ציטומטרי זרימה של דגימות התא, הגדר ציטומטר זרימה המצויד ב קורא לוחות תפוקה גבוהה כדי למשוך 175 מיקרוליטרים של מדגם ולאסוף 5000 תאים ל הבאר. בצע את gating הראשונית כדי לחסל כפילים ופסולת על פיזור קדימה לעומת חלקת פיזור בצד.השתמש פיזור בצד לעומת עלילה כתם הכדאיות כדי לחסל את התאים המתים. ולהשתמש פיזור בצד לעומת העלילה CD45 כדי להבדיל את המעמדות הגדולים leukocyte. עבור כל התאים החיוביים CD45, או עבור כל תת קבוצה של לויוציטים של עניין, למדוד את פעילות phagocytosis הסלולר תלוי הנוגדן על ידי gating עם סמן על התאים החיוביים חרוזים בהיסטוגרמה של ערוץ פלואורופור המתאים עבור חרוזים משותף.לאחר מכן לחשב את הנוגדן תלוי phagocytosis הסלולר ציונים כמו החציון של עוצמת הפלואורסצנטיות של תאים חיוביים חרוז באחוזים של CD45 הכולל בתוספת התאים באוכלוסייה החיובית. כאן מוצגת אסטרטגיית הגתה לחיסול כפילים, פסולת ותאים מתים. בין אחד ל -12% מכלל התאים החיים הם בדרך כלל CD45 לויוציטים חיוביים כאשר רוב פיזור הצד כביכול נמוך עד בינוני CD45 מונוציטים נמוכים שנראים מבשרים, או לתאים לא בוגרים, בהתבסס על פיזור הצד לעומת CD45 gating.הגרנולוציטים כביכול מוגדרים כפיזור צד גבוה, תאי ביניים CD45. מדידת פעילות ADCP של תאי חלב אם מבודדים טריים באמצעות נוגדן חד שבטי אנושי ספציפי ל- HIV בחודש אחד לאחר הלידה מגלה כי טיפול במעכב אקטין ציטוכלאסין D וקולטן Fc החוסם נוגדנים לפני הדגירה עם נוגדנים הקשורים לאנטיגן תוצאות פעילות ADCP ב או מתחת שנצפו בנוכחות נוגדן בקרה. ציון ADCP שנקבע עבור תאים חיוביים CD45 הכולל הוא בדרך כלל בין 25 ל 35 לקפל מעל רמות הרקע, מוגדר באמצעות שליטה שלילית, נוגדן חד שבטי אנטי אנתרקס.כל דגימת חלב אם היא ייחודית וכמה כדורי עשוי להיות קשה לראות. בנוסף, אוכלוסיות לויוציט, ולכן ציוני ADCP, עשויים להשתנות מאוד מדגם לדגימה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...