Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
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シナイ山のイカーン医学部の医学科と微生物学科のスーザン・ゾラ・パズナー博士に原稿のレビューを感謝します。NIH/NICHDは、補助金番号R21 HD095772-01A1の下で、このプロジェクトのための資金を提供しました。また、R.パウエルは、シナイ山のイカーン医学部感染症学科医学部の資金によって支援されました。

この研究の各参加者は、IRB承認を使用してシナイ山のヒト被験者保護プログラム(PPHS)の指導と承認を受けて、倫理的および制度的レビュー委員会(IRB)の承認に合わせて募集され、インタビューを受けました。母乳サンプルを得るためのプロトコル。
1. ターゲットマイクロスフィアの準備
<ol><li>関連する標的抗原を選択します。 注:この例では?...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk.">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li><li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons.">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring:+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth.">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li><li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals.">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li><li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding:+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer's+Patches+of+the+Nursed+Infant.">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).</li><li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates.">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).</li><li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants.">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries:+a+pooled+analysis.">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies.">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li><li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1.">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).</li><li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+(ADCC)+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality.">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li><li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1.">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li><li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody Fc. , (2014).</li><li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

ここに記載されているADCP活性を測定するためのフローサイトメトリーベースの技術は、最初に201130に記載され、それ以来、80以上の研究で堅牢であることが証明され、引用されています。ここで説明するプロトコルは、この手法を初めて一次 BM セルで使用するために適応します。BM細胞によるFc媒介機能の以前の研究は、大きく異形成後(生後0−4日)から分離された細胞を用?...

ヒト母乳(BM)は、>90%生存可能な母細胞で構成されています。細胞組成物は、授乳の段階、母子および乳児の健康状態、および個々の変動によって強く影響を受け、1、2、3、4の理解が不十分なままである。BMが~103−105白血病/mLを含有することを考えると、母乳で育てられた乳児が毎日〜105−108母性白血病を毎日摂取すると推定できる。様々な生体内白球が乳児に重要な免疫を提供し、初期摂取5、6、7、8のこれらの部位をはるかに超えて機能的であることを実証した。 ,9,10,11.乳児によって摂取されたすべての母体由来細胞は、乳児自身の白血病細胞12と一緒に免疫機能を実行する可能性を有する。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の母子感染(MTCT)は、資源に限られた国では依然として危機的状況にある。下痢や呼吸器疾患は、資源に限られた国の乳児の死亡率の実質的な割合を占めており、これらの病気は排他的な母乳育児によって大幅に減少し、HIVに感染した母親への利益母乳育児はリスク13、14、15をはるかに上回る。きれいな水と適切な乳児用製剤へのアクセスが信頼できる場合を除き、WHOはHIVに感染した母親のための母乳育児の中止を推奨していません16.毎年約 100,000 の MtCT が BM 経由で発生します。しかし、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%のみが感染し、BM 17、18、19、20、21の強力な保護効果を示唆している。多くの要因は、伝送を防ぐために連携して動作する可能性が高いです。重要なことに、BMにおけるHIV特異的抗体(Abs)は、HIV感染によるMTCTの減少および/または乳児死亡の減少と相関している22,23である。主に不明なのは、BMの細胞画分がその抗ウイルス性に対する寄与である。
多くのAbsは、免疫グロブリン分子の「一定」領域、結晶化性断片(Fc)、事実上すべての自然免疫細胞に見られるFc受容体(FcR)との相互作用を介して媒介する様々な抗ウイルス活性を促進し、事実上その全てヒトBM24で見つかった.抗体依存性細胞性細胞症(ADCP)は、ウイルス感染のクリアランスのために必要に応じて実証されており、HIV25、26、27のMTCTの予防の場合に研究されている。28歳,29.BMファゴサイトによるHIVのMTCTの予防に対するADCP活性の潜在的な寄与に関する知識の不足を考慮し、細胞媒介性ADCPの研究を行うために、ヒトBMから細胞を単離する厳格な方法を開発することを目指した。BMは授乳の様々な段階で得られる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

抗レトロウイルス薬がなくても、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%のみが感染し、母乳(BM)の強力な保護効果を示唆している。清潔な水と適切な乳児用の処方へのアクセスが信頼できる場合を除き、WHOはHIVに感染した母親のための母乳育児の中止を推奨しません。BM伝送を減らすために、多くの要因が連携して動作する可能性が高い。母乳で育てられた乳児は毎日〜105−108母性白血病を摂取し、大部分は不明であるが、これらの細胞がBMの抗ウイルス性に対する寄与である。抗体依存性細胞性細胞細胞症(ADCP)は、HIV標的に対するBMファゴサイトによる最も本質的かつ広範な自然免疫応答の1つである。細胞を授乳の様々な段階で得られた5つのヒトBMサンプルから単離した。分離は穏やかな遠心分離を介して行われ、続いて乳脂肪を注意深く除去し、細胞ペレットを繰り返し洗浄した。HIVエンベロープ(Env)エピトープでコーティングされた蛍光ビーズをADCPの分析対象として用いた。細胞をCD45表面マーカーで染色し、白血病を同定した。ADCP活性は、HIV特異的抗体830Aを用いて対照実験を上回り、再現可能に測定可能であることが判明した。

牛乳は室温またはクーラーで保つことができます(ただし、凍結していません)。しかし、牛乳が非常に冷たく保たれている場合の生存率が低下していることを考えると(データは示されていない)、周囲の温度で採取、保存、輸送が簡単であることを考えると、サンプルを減らすために冷蔵しないことをお勧めします。サンプル間の変動性。7−183日分娩後に得られた牛?...

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Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

母乳はヒト免疫不全ウイルス(HIV)を伝播するが、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%だけが感染する。母乳で育てられた乳児は毎日〜105−108母性白血病を摂取するが、これらの細胞は研究されている。ここでは、母乳白球の単離と、その間に行能力の分析について説明する。

HIV標的の抗体依存性細胞性性性過小細胞症アッセイにおけるヒト母乳からの白球細胞の単離

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

ヒトの母乳から細胞を単離し、HIV標的に対する母乳食細胞による抗体依存性細胞食細胞食細胞(ADCP)を研究するための厳格な方法を開発しました。この技術は、ADCPを実行する白血球集団の容量を評価するために、母乳細胞の比較的迅速かつ容易な単離を容易にする。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるアリサ・フォックスです。関連する標的抗原を選択した後、市販キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って目的のタンパク質をビオチン化します。そして、スピンカラムの上部チャンバーにビオチン化サンプルを堆積させる。PBSを最大400マイクロリットルに加え、遠心分離のためにカラムを回収管に挿入する前にチャンバーにキャップします。流れを捨て終えた後、PBSを400マイクロリットルに加えて2番目の遠心分離を行います。流れを捨て、400マイクロリットルにPBSを加え、分光光度計でタンパク質濃度を測定し、ビオチン化タンパク質をマイクロメートルのマイクロスフィアに結合させます。コンジュゲートビーズのプレートあたり200マイクロリットルのPBSに12マイクロリットルのストックビーズを20マイクロリットルで20マイクログラムのタンパク質で2時間インキュベートし、20分ごとに穏やかな渦を生かします。インキュベーションの終わりに、ペレットは、タンパク質をコンジュゲートビーズ遠心分離により、上清を捨てる。穏やかなボルテックスの後、PBSで0.1%BSAの1200マイクロリットルでタンパク質を再懸濁し、ちょうど実証したようにさらに2回遠心分離によってチューブを洗浄する。最後の洗浄後、PBSプラスBSAで1200マイクロリットルのペレットを再懸濁します。ADCPアッセイプレートをセットアップするには、まず、12マイクロリットルの抗体、または対象の免疫血清を、ラウンドボトム96ウェルプレートでPBS中の2%BSAに調製する。37°Cで2時間のインキュベーションのためにプレートにウェルごとにタンパク質共役ビーズの10マイクロリットルを追加します。インキュベーションの最後に、PBSとBSAの200マイクロリットルを加えます。ポンプを用いて発現する健康な授乳中の女性からヒト母乳を得た後、4時間以内に、母乳内容物を遠心分離によって分離し、スキムミルクと脂肪を慎重に注ぎ、細胞ペレットを乱さずに残す。糸くずのないワイプでチューブの内側を拭き取り、チューブウォールから脂肪をすべて取り除き、PBSプラスHSAの10ミリリットルを追加します。アポトーシスで細胞の活性化を避けるために穏やかなピペットでペレットを再懸濁し、遠心分離のために細胞懸濁液を15ミリリットルチューブに移します。ちょうど実証したようにPBSプラスHSAで2回目の洗浄の後、カウントのために新鮮なPBSとHSAの1〜2ミリリットルの細胞を穏やかに再懸濁します。ADCPアッセイの場合、準備されたADCPプレートを素早く反転して、最終的な遠心分離後に上澄み物をデカントし、PBSとBSAの200マイクロリットルで4番目に分離された母乳細胞で5倍の10を加え、摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、細胞を遠心分離し、示したように200マイクロリットルの新鮮なPBSでペレットを2回洗浄する。最後の洗浄後、室温で30分間PBSの50マイクロリットルで1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの固定可能な生き生き性染色体450を室温で30分間染色し、光から保護する。インキュベーションの終わりに、示されているように、新鮮なPBSで2回の洗剤用細胞をペレット化し、目的の白血球マーカーの細胞を室温で30分間染色し、光から保護する。インキュベーションの終了時に、細胞遠心分離を収集し、1回の洗浄につき1%BSAプラスPBSの200マイクロリットルで細胞を2回洗浄します。最後の洗浄後、ペレットを1ウェルあたり0.5%ホルムアルデヒドを光から保護して30分間、200マイクロリットルのホルムアルデヒドで固定します。細胞サンプルのフローサイトメトリック解析では、175マイクロリットルのサンプルを回収し、ウェルあたり5000個の細胞を収集するために、ハイスループットプレートリーダーを装備したフローサイトメーターを設定します。最初の格子を実行して、前方散乱と側面の散布図でダブレットとデブリを除去します。死んだ細胞を排除するために、サイドスキャッタ対生存性染色プロットを使用します。また、主な白血球クラスを区別するために、サイドスキャッタ対CD45プロットを使用します。すべてのCD45陽性細胞、または対象の各白血球サブセットについて、結合ビーズに対する適切なフルオロフォアチャネルのヒストグラム中のビーズ陽性細胞上のマーカーでゲーティングすることによって抗体依存性細胞貪食活性を測定する。次に、抗体依存性細胞貪食スコアを、全CD45+陽性集団の細胞の割合でビーズ陽性細胞の蛍光強度の中央値として算出する。ここでは、ダブレット、デブリ、死細胞を排除するための格言戦略が示されている。生細胞全体の1〜12%の間には、典型的にはCD45陽性白血球であり、大部分の側散乱は低く、中間CD45は前駆体であるように見える低い単球、または未熟な細胞に対して、側散乱対CD45格子に基づく。この顆粒球と称される細胞は、高い、CD45中間細胞の側散乱と定義される。産後1ヶ月でHIV特異的ヒトモノクローナル抗体を用いた新たに単離された母乳細胞のADCP活性を測定した結果、抗体結合型ビーズによるインキュベーション前にアクチン阻害剤Cytochalasin DおよびFc受容体遮断抗体による治療が、コントロール抗体の存在下で観察されたADCP活性の結果を生じることが明らかになった。総CD45陽性細胞について決定されたADCPスコアは、一般的にバックグラウンドレベルより25〜35倍の間であり、陰性対照、抗炭疽モノクローナル抗体を使用して定義される。すべての母乳サンプルはユニークであり、いくつかのペレットは見るのが難しいかもしれません。さらに、白血球集団、したがってADCPスコアは、サンプルごとに大きく異なる可能性があります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

脳浸潤白血球の分離

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...