Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

우리는 원고 검토를 위해 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학의 의학 및 미생물학과에서 수잔 졸라 - 파즈너 박사에게 감사드립니다. NIH/NICHD는 보조금 번호 R21 HD095772-01A1에 따라 이 프로젝트에 대한 자금을 제공했습니다. 또한, R. 파월은 시나이 산의 이칸 의과 대학, 감염증 학과의 기금으로 지원되었습니다.

이 연구의 각 참가자는 IRB 승인을 사용하여 시나이 산의 인간 피험자 보호 프로그램 (PPHS)의 지침 및 승인과 함께 윤리적 및 제도적 검토 위원회 (IRB) 승인에 따라 모집및 인터뷰되었습니다. 모유 샘플을 얻기위한 프로토콜.
1. 표적 마이크로스피어 준비
<ol><li>관련 표적 항원을 선택합니다. 참고: 이 예에서는, 재조합 단백질 V1V2-2F5K가 사용되었고, ...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. 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Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. 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C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

본원에 기재된 ADCP 활성을 측정하기 위한 유세포 분석 기반 기술은 2011년30년에 처음 기술되었으며, 이후 80개 이상의 연구에서 견고하게 입증되고 인용되었다. 여기에 설명된 프로토콜은 이 기술을 1차 BM 세포와 처음으로 사용하기 위해 적응합니다. BM 세포에 의한 Fc 매개 기능의 이전 연구는 초유로부터 분리된 세포를 사용하여 산화 파열 또는 장기학 기반 식세포 분석법의 측정...

인간 모유 (BM)는 >90% 실행 가능한1모계 세포로 구성됩니다. 세포 조성은 수유의 단계, 어머니와 유아의 건강 상태 및 개인 변화에 의해 강하게영향을 받는데, 이는1,2,3,4. BM이 ~ 103-105 백혈구 / mL을 함유하고 있음을 감안할 때, 모유 수유 된 유아가매일~ 105-108 모계 백혈구를 섭취한다고 추정 할 수 있습니다. 생체 내 다양한 연구는 모계 백혈구가 유아에게 중요한 면역력을 제공하고 초기섭취5, 6,7,8의 이러한 부위를 훨씬 넘어서 는 기능성을 입증했습니다. ,9,10,11. 유아에 의해 섭취된 모든 모계 유래 세포는 유아의 백혈구12와함께 면역 기능을 수행하거나 보상할 가능성이 있다.
인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 어머니 -투 - 아이 전송 (MTCT)는 자원 제한 국가에서 위기 남아있다. 설사와 호흡기 질환이 자원 제한 국가에서 유아 중 사망률의 상당한 비율에 대한 책임이 있기 때문에, 이러한 질병은 독점적 인 모유 수유에 의해 크게 감소, HIV에 감염된 어머니에게 혜택 모유 수유는 위험13,14,15보다훨씬 큽니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된산모16에대한 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM을 통해 대략 100,000 선교사 훈련원은 매년 발생합니다; 아직, HIV에 감염된 산모에 의해 모유수유를 한 유아의 ~15%만이 감염되어 BM17,18,19,20,21의강력한 보호 효과를 시사한다. 수많은 요인이 전송을 방지하기 위해 함께 작동 할 가능성이 높습니다. 중요한 것은, BM에 있는 HIV 특정 항체 (Abs)는 HIV 감염22,23에서감소된 MTCT 및/또는 감소된 유아 죽음과 상관되었습니다. 크게 불분명 남아 있는 것은 그것의 항 바이러스 자질에 BM의 세포 분획의 기여.
많은 Abs는 면역 글로불린 분자의 '일정한' 영역에 의해 매개되는 다양한 항 바이러스 활동을 촉진하며, 결정화 가능한 단편(Fc)은 사실상 모든 선천성 면역 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcRs)와의 상호작용을 통해 사실상 모든 항바이러스 작용을 촉진합니다. 인간 BM24에서발견된다. 항체 의존성 세포 식세포증(ADCP)은 바이러스 감염의 허가를 위해 필요에 따라입증되었으며 HIV25,26,27의MTCT 예방의 경우 과소 연구되어왔다. 28세 , 29. HIV의 MTCT 예방에 BM 식세포에 의한 ADCP 활동의 잠재적 기여에 대한 지식의 빈약함을 감안할 때, 우리는 세포에 의해 매개 된 ADCP의 연구를 수행하기 위해 인간 BM에서 세포를 분리하는 엄격한 방법을 개발하는 것을 목표로했습니다. BM은 수유의 다양한 단계에서 얻은.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

항 레트로 바이러스 약물이없는 경우에도 HIV에 감염된 어머니가 모유를 수유한 유아의 ~ 15 %만이 감염되어 모유 (BM)의 강력한 보호 효과를 시사합니다. 깨끗한 물과 적절한 유아용 분유에 대한 접근이 신뢰할 수 없다면, WHO는 HIV에 감염된 산모에게 모유 수유를 중단할 것을 권장하지 않습니다. BM 전송을 줄이기 위해 여러 가지 요인이 함께 작동할 가능성이 높습니다. 모유로 기르는 유아는 매일 ~ 105-108 모계 백혈구를 섭취하지만, 크게 불분명남아있는 것은 BM의 항 바이러스 특성에 대한 이러한 세포의 기여입니다. 항체 의존성 세포 식세포증 (ADCP), HIV 표적에 대하여 BM 식세포에 의해 가장 필수적이고 보편적인 선천적인 선천적인 면역 반응의 한개. 세포는 수유의 다양한 단계에서 수득된 5개의 인간 BM 샘플로부터 분리되었다. 격리는 부드러운 원심분리를 통해 수행되었고, 그 다음에 우유 지방을 주의 깊게 제거하고 세포 펠릿을 반복적으로 세척시켰다. HIV 봉투(Env) 에피토프로 코팅된 형광 비드는 ADCP의 분석을 위한 표적으로 사용하였다. 세포는 백혈구를 확인하기 위해 CD45 표면 마커로 염색하였다. ADCP 활성이 HIV 특이적 항체 830A를 사용하여 대조군 실험 및 재현 가능한 측정가능한 위 유의한 것으로 나타났다.

우유는 실온이나 쿨러에서 보관 할 수 있습니다 (냉동되지는 않지만); 그러나 우유가 매우 차갑게 유지되었을 때 생존 가능성이 감소(데이터가 표시되지 않음)를 관찰하고 주변 온도에서 간단하게 수집, 보관 및 운반이 더 간단하다는 점을 감안할 때, 시료를 줄이기 위해 냉장보관하지 않는 것이 좋습니다. 샘플 간 가변성. 산후 7-183일 동안 얻은 우유에서, 자동화된 세포 ?...

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Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

모유는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)를 전송하지만 HIV에 감염된 어머니가 모유로 기르는 유아의 15 %만이 감염됩니다. 모유로 기르는 유아는 ~ 105-10 8 이 세포가 understudyed 하더라도 매일8 개의 모계 백혈구를 섭취합니다. 여기에서 우리는 모유 백혈구의 격리및 그들의 식세포 용량의 분석을 기술합니다.

HIV 표적의 항체 의존적 세포 식세포 분석에서 사용하기 위해 인간 모유에서 백혈구의 분리

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

우리는 HIV 표적에 대하여 모유 phagocytes에 의하여 항체 의존적인 세포 phagocytosis, 또는 ADCP를 공부하기 위하여 인간 적인 모유에서 세포를 격리하는 엄격한 방법을 개발했습니다. 이 기술은 ADCP를 수행하기 위해 백혈구 집단의 용량을 평가하기 위해 모유 세포의 비교적 빠르고 쉬운 격리를 용이하게합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 알리사 폭스 (Alisa Fox)가 될 것입니다.관련 표적 항원을 선택한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 관심 있는 단백질을 생체화하기 위해 상용 키트를 사용합니다. 그리고 바이오티니드 샘플을 스핀 컬럼의 상부 챔버에 증착한다. PBS를 최대 400마이크로리터를 추가하고 원심분리를 위해 컬럼을 수집 튜브에 삽입하기 전에 챔버를 캡합니다.흐름을 폐기한 후 PBS를 400마이크로리터에 추가하여 두 번째 원심분리를 합니다. 흐름을 버리고, 400 마이크로리터에 PBS를 추가하고, 분광계에 의한 단백질 농도를 측정하여 생체화 단백질을 마이크로미터 마이크로스피어에 수렴한다. 20분마다 부드러운 소용돌이와 함께 2시간 동안 실온에서 컨쥬게이트 구슬 당 PBS 200 마이크로리터200 마이크로리터에 12 마이크로리터의 스톡 비드를 장착한 6마이크로그램의 단백질을 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 단백질은 원심분리에 의해 구슬을 컨쥬게이징하고 상퍼를 버린다. 부드러운 소용돌이 후, PBS에서 0.1 %의 BSA의 1200 마이크로 리터에서 단백질을 다시 중단하고, 단지 입증된 바와 같이 원심 분리에 의해 튜브를 두 번 더 세척합니다. 마지막 세척 후, PBS 플러스 BSA에서 1200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단.ADCP 분석판을 설정하려면 먼저 12개의 마이크로리터 희석제 또는 관심있는 면역 혈청을 PBS에서 2%BSA로 라운드 하단 96 웰 플레이트로 준비한다. 37°C에서 2시간 동안 접시에 잘 섞인 단백질 구슬 10마이크로리터를 첨가합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 플러스 BSA의 200 마이크로리터를 추가합니다.펌프를 사용하여 표현하는 건강한 수유 여성으로부터 인간의 모유를 얻은 후, 발현 4 시간 이내에 원심 분리에 의해 우유 내용을 분리하고 조심스럽게 탈지 우유와 지방을 부어 세포 펠릿을 방해받지 않고 둡시. 튜브 벽을 완전히 제거하고 PBS 플러스 HSA의 10 밀리리터를 추가하기 위해 보풀이없는 와이프로 튜브 내부를 닦으십시오. 팔버토시스에서 세포 활성화를 피하기 위해 부드러운 파이펫팅으로 펠릿을 다시 중단하고, 세포 현탁액을 원심분리를 위한 15 밀리리터 튜브로 옮긴다.방금 입증 된 바와 같이 PBS 플러스 HSA에서 두 번째 세척 후, 부드럽게 계산에 대한 신선한 PBS 플러스 HSA의 1 ~ 2 밀리리터에 세포를 다시 중단. ADCP 분석의 경우, 준비된 ADCP 플레이트를 신속하게 반전하여 최종 원심분리 후 상체를 감소시키고 PBS 의 200 마이크로리터에 4번째로 새로 분리된 모유 세포에 5회 10번을 추가하여 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 세포를 원심분리하고 입증된 바와 같이 신선한 PBS의 200 마이크로리터에서 두 번 펠릿을 세척한다.마지막 세척 후, 실온에서 30 분 동안 PBS의 50 마이크로 리터에 잘 당 450 고정 생존성 스테인의 밀리리터 당 0.5 마이크로 그램으로 세포를 얼룩, 빛으로부터 보호. 인큐베이션의 끝에서, 입증된 바와 같이 신선한 PBS에서 두 개의 세척세포를 펠렛하고, 실온에서 30분 동안 관심 있는 백혈구 마커에 대한 세포를 얼룩지게 하여 빛으로부터 보호한다. 인큐베이션의 끝에서, 세포 원심분리를 수집하고, 세척당 1%BSA 플러스 PBS의 200 마이크로리터에서 세포를 두 번 세척한다.마지막 세척 후, 200 마이크로리터의 0.5% 포름알데히드의 200 마이크로리터에 체온으로부터 30분 동안 고정하여 빛으로부터 보호합니다. 세포 샘플의 유동 세포 측정 분석을 위해, 고처리량 플레이트 판독기가 장착된 유동 세포계를 설정하여 175마이크로리터의 시료를 인출하고 우물당 5000세포를 수집한다. 측면 분산 플롯대 전방 산란에 이중및 이물질을 제거하기 위해 초기 게이팅을 수행합니다.죽은 세포를 제거하기 위해 생존 성 얼룩 플롯 대 측면 산란을 사용합니다. 그리고 주요 백혈구 클래스를 구별하기 위해 CD45 플롯 대 측면 산란을 사용합니다. 모든 CD45 양성 세포또는 각 백혈구 하위 집합에 대해, 공주비에 대한 적절한 플루오로포어 채널의 히스토그램에서 비드 양성 세포에 마커로 게이팅하여 항체 의존성 세포 식세포 활성을 측정한다.그런 다음 항체 의존성 세포 phagocytosis 점수를 비드 양성 세포의 형광 강도의 중앙값으로 총 CD45의 백분율로 계산하고 양성 집단의 세포를 더하였다. 여기서는 이중, 파편 및 죽은 세포를 제거하기위한 게이팅 전략이 표시됩니다. 총 살아있는 세포의 1~12%는 전형적으로 CD45 양성 백혈구이며, 대부분의 의도적인 측면은 구체체로 나타나는 낮은 CD45 낮은 단백세포또는 CD45 개팅 대 측면 산란에 기초하여 미숙한 세포로 산란된다.의도적인 과립구는 측면 산란 높은, CD45 중간 셀로 정의된다. 한 달 산후에서 HIV 특정 인간 단일 클론 항체를 사용하여 갓 분리 된 모유 세포의 ADCP 활성을 측정하면 항체 바운드 항원 결합 비드가 있는 배양 전에 액틴 억제제 Cytochalasin D 및 또는 Fc 수용체차단 항체를 사용한 치료가 대조항체의 존재에서 관찰된 ADCP 활성을 초래한다는 것을 알 수 있습니다. 총 CD45 양성 세포를 위해 결정된 ADCP 점수는 일반적으로 배경 수준 보다 25~35배 사이이며, 음의 대조군, 항탄트락스 단일클론 항체를 사용하여 정의된다.모든 모유 샘플은 고유하며 일부 펠릿은 보기 어려울 수 있습니다. 또한 백혈구 인구, 따라서 ADCP 점수는 샘플에서 샘플마다 엄청나게 다를 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...