Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Сьюзан Золла-Пазнер на кафедре медицины и кафедре микробиологии в Медицинской школе Икан на горе Синай за отзыв рукописей. NIH/NICHD предоставила финансирование этого проекта под грантовый номер R21 HD095772-01A1. Кроме того, Р. Пауэлл был поддержан за счет средств из Департамента медицины, Отдел инфекционных заболеваний, Icahn школы медицины на горе Синай.

Каждый участник этого исследования был набран и опрошен в соответствии с утверждением этического и институционального совета по обзору (IRB) с руководством и разрешением Программы по защите человеческих субъектов (PPHS) с использованием одобренного IRB протокол для получения образцов гру?...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk.">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li><li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons.">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring:+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth.">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li><li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals.">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li><li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding:+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer's+Patches+of+the+Nursed+Infant.">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).</li><li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates.">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).</li><li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants.">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries:+a+pooled+analysis.">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies.">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li><li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1.">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).</li><li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+(ADCC)+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality.">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li><li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1.">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li><li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody Fc. , (2014).</li><li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

Метод цитометрии на основе потока для измерения активности ADCP, описанный в настоящем вопросе, был впервые описан в 2011году 30 и с тех пор был доказан надежным и цитируется в более чем 80 исследованиях. Описанный здесь протокол впервые адаптирует этот метод для использования с ...

Грудное молоко человека (BM) состоит из материнских клеток, которые являются жизнеспособными1. Состав клеток сильно влияет на стадию лактации, состояние здоровья матери и младенца, и индивидуальный вариант, который остается плохоизученным1,2,3,4. Учитывая, что БМ содержит 103й 105 лейкоцитов/мл, можно подсчитать, что грудное вскармливание младенцев глотать 105и 108 материнских лейкоцитов ежедневно5. Различные исследования in vivo показали, что материнские лейкоциты обеспечивают критический иммунитет к младенцу и функционируют далеко за пределами этих мест первоначального приема5,6,7,8 ,9,10,11. Все материнские клетки, проглоченные младенцем, обладают потенциалом для выполнения иммунных функций наряду или для компенсации собственных лейкоцитов младенца12.
Передача вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) от матери ребенку остается кризисом в странах с ограниченными ресурсами. Поскольку диарейные и респираторные заболевания являются причиной значительных показателей смертности среди младенцев в странах с ограниченными ресурсами, и эти болезни значительно сокращаются за счет исключительно грудного вскармливания, выгоды для ВИЧ-инфицированных матерей грудное вскармливание намного перевешивает риски13,14,15. Если доступ к чистой воде и соответствующим детским смесям не является надежным, ВОЗ не рекомендует прекратить грудное вскармливание для ВИЧ-инфицированных матерей16. Приблизительно 100 000 MTCTs через БМ происходят ежегодно; тем не менее, только 15% младенцев, накормленных грудью их ВИЧ-инфицированных матерей заражаются, предполагая сильный защитный эффект BM17,18,19,20,21. Многочисленные факторы, вероятно, работают в тандеме, чтобы предотвратить передачу инфекции. Важно отметить, что ВИЧ-специфические антитела (Abs) в БМ были коррелированы с сокращением MTCT и / или снижение младенческой смертности от ВИЧ-инфекции22,23. Что остается в значительной степени неясным является вклад клеточной фракции БМ его противовирусные качества.
Многие Abs облегчить различные антивирусные деятельности при посредничестве "постоянной" области молекулы иммуноглобулина, кристаллизуемый фрагмент (Fc), через взаимодействие с рецепторами FC (FcRs) найти практически на всех врожденных иммунных клеток, практически все из которых встречаются в человеке BM24. Антитела-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) был продемонстрирован как необходимый для очистки вирусных инфекций и был недостаточно изучен в случае профилактики MTCT ВИЧ25,26,27, 28 , 29. Учитывая нехватку знаний о потенциальном вкладе активности ADCP бМ фагоцитов в профилактику MTCT ВИЧ, мы стремились разработать строгий метод изоляции клеток от человеческого БМ для проведения исследования ADCP при посредничестве клеток из БМ, полученный на различных стадиях лактации.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

Даже при отсутствии антиретровирусных препаратов, только 15% младенцев, накормленных ВИЧ-инфицированными матерями, заражаются, что свидетельствует о сильном защитном эффекте грудного молока (БМ). Если доступ к чистой воде и соответствующим детским смесям не является надежным, ВОЗ не рекомендует прекратить грудное вскармливание для ВИЧ-инфицированных матерей. Многочисленные факторы, вероятно, работают в тандеме, чтобы уменьшить передачу БМ. Грудное вскармливание младенцев глотать 105и 108 материнских лейкоцитов ежедневно, хотя то, что остается в значительной степени неясно, является вклад этих клеток в противовирусные качества БМ. В настоящее время мы стремились изолировать клетки от человека БМ для того, чтобы измерить антитела-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), один из самых важных и всепроникающих врожденных иммунных реакций, бМ-фагоцитов против ЦЕЛЕй ВИЧ. Клетки были выделены из 5 образцов БМ человека, полученных на различных стадиях лактации. Изоляция осуществлялась с помощью мягкой центрифугации с последующим тщательным удалением молочного жира и повторным промыванием клеточных гранул. Флуоресцентные бусы, покрытые эпитопом конверта С ВИЧ (Env), использовались в качестве мишеней для анализа ADCP. Клетки были окрашены маркером поверхности CD45 для идентификации лейкоцитов. Было установлено, что активность ADCP была значительно выше контрольных экспериментов и воспроизводима с помощью АНТИтела 830А, характерного для ВИЧ.

Молоко можно хранить при комнатной температуре или прохладнее (хотя и не замороженное); однако, учитывая, что мы наблюдали снижение жизнеспособности, когда молоко было сохранено очень холодно (данные не показали), и что проще собирать, хранить кратко, и транспортироват?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Грудное молоко передает вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), хотя только 15% младенцев, накормленных ВИЧ-инфицированными матерями, заражаются. Грудное вскармливание младенцев глотать 105и 108 материнских лейкоцитов ежедневно, хотя эти клетки недостаточно изучены. Здесь мы описываем изоляцию лейкоцитов грудного молока и анализ их фагоцитарной способности.

Изоляция лейкоцитов от грудного молока человека для использования в антитела-зависимых клеточного фагоцитоза Ассей ВИЧ Цели

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Мы разработали строгий метод изоляции клеток от грудного молока человека для изучения антител зависимого клеточного фагоцитоза, или ADCP, фагоцитами грудного молока против целей ВИЧ. Этот метод облегчает относительно быструю и легкую изоляцию клеток грудного молока для оценки способности популяций лейкоцитов выполнять АДКП. Демонстрацией процедуры будет Алиса Фокс, техник из моей лаборатории.После выбора соответствующего целевого антигена используйте коммерческий комплект для биотинилатного белка, представляющих интерес в соответствии с протоколом производителя. И отмести биотинилированный образец в верхнюю камеру спиновой колонки. Добавьте PBS до 400 микролитров и крышка камеры перед вставкой колонки в трубку сбора для центрифугации.После отбрасывания потока через, добавить PBS до 400 микролитров для второй центрифугации. Отбросьте поток через, добавить PBS до 400 микролитров, и измерить концентрацию белка с помощью спектрофотометра, чтобы спрягать биотинилированный белок в микросферы микрометра. Инкубировать шесть микрограммов белка с 12 микролитров бульона в 200 микролитров PBS на тарелку спряженных бусин при комнатной температуре в течение двух часов, с нежным вихрем каждые 20 минут.В конце инкубации, гранулы белка конъюгированных бусин центрифугации и отказаться от супернатанта. После нежного вихря, повторное потребление белка в 1200 микролитров 0,1%BSA в PBS, и мыть трубку центрифугации еще в два раза, как только что продемонстрировали. После последней стирки, повторно гранулы в 1200 микролитров в PBS плюс BSA.Для настройки ADCP Assay Плиты, сначала подготовить 12 микролитер разбавления антител, или иммунной сыворотки интереса, в 2%BSA в PBS в круглом нижней 96 хорошо пластины. Добавьте 10 микролитров протеиновых конъюгированных бусинок на колодец в течение двух часов инкубации при 37 градусах цельсия. В конце инкубации добавьте 200 микролитров PBS плюс BSA.После получения грудного молока человека от здоровых кормящих женщин, выражают с помощью насоса, в течение четырех часов выражения отделить содержание молока центрифугации и тщательно слить обезжиренное молоко и жир, оставляя гранулы клетки нетронутыми. Протрите внутреннюю часть трубки с ворсинки, свободной от салфетки, чтобы удалить весь жир из трубки стенки и добавить 10 миллилитров PBS плюс HSA. Повторное подвесной гранулы с нежным пипетки, чтобы избежать активации клеток в апоптоз, и передать клеточной подвески на 15 миллилитров трубки для центрифугации.После второй стирки в PBS плюс HSA, как только что продемонстрировано, мягко повторного перерасхода клеток в один-два миллилитров свежих PBS плюс HSA для подсчета голосов. Для ADCP Assay, быстро инвертировать подготовленные пластины ADCP, чтобы декантировать супернатант после окончательного центрифугации и добавить пять раз 10 на четвертом свежеисполнимых клеток грудного молока в 200 микролитров PBS плюс BSA в течение двух часов инкубации при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации центрифуга клетки и мыть гранулы два раза в 200 микролитров свежих PBS, как попродемонстрировано.После последней стирки, пятно клеток с 0,5 микрограмма на миллилитр фиксации жизнеспособности пятно 450 на колодец в 50 микролитров PBS в течение 30 минут при комнатной температуре, защищены от света. В конце инкубации гранулы клеток в течение двух моет в свежем PBS, как попродемонстрировано, и пятно клеток для лейкоцитов маркеры интереса в течение 30 минут при комнатной температуре, защищены от света. В конце инкубации, собирать центрифугации клеток, и мыть клетки два раза в 200 микролитров 1%BSA плюс PBS за стирку.После последней стирки, исправить гранулы в 200 микролитров 0,5%формальдегида на колодец в течение 30 минут при комнатной температуре, защищены от света. Для цитометрического анализа потока образцов клеток установите цитометр потока, оснащенный высокопроницаемым считывателем пластин, чтобы снять 175 микролитров образца и собрать 5000 клеток на колодец. Выполните первоначальный gating для устранения дублетов и мусора на вперед рассеяния по сравнению с боковой участок рассеяния.Используйте боковой рассеяния против жизнеспособности пятно участок для устранения мертвых клеток. И использовать боковой рассеяния по сравнению с CD45 участок дифференцировать основные классы лейкоцитов. Для всех CD45 положительных клеток, или для каждого подмножества лейкоцитов интерес, мера антитела зависимых клеточных фагоцитоз деятельности путем gating с маркером на бисер положительные клетки в гистограмме соответствующего канала флюорофора для спряженных бусин.Затем вычислить антитела зависимых клеточных фагоцитоз оценки, как медиана флуоресценции интенсивности бисера положительных клеток на процент от общего CD45 плюс клетки в положительной популяции. Здесь показана стратегия вымывания дублетов, мусора и мертвых клеток. От одного до 12% от общего числа живых клеток, как правило, CD45 положительные лейкоциты с большинством предполагаемых бокового рассеяния от низкого до промежуточного CD45 низких моноцитов, как представляется, предшественники, или незрелые клетки, на основе бокового рассеяния по сравнению с CD45 gating.Предполагаемые гранулоциты определяются как боковые рассеяния высоких, CD45 промежуточных клеток. Измерение активности ADCP свежеиспользуемых клеток грудного молока с использованием ВИЧ-специфического человеческого моноклонального антитела в течение одного месяца после родов показывает, что лечение актином ингибитором Cytochalasin D и или рецептором Fc, блокирующим антитела до инкубации с антителами связанных антигена в сочетании с бисером, приводит к активности ADCP на уровне или ниже, что наблюдается в присутствии контроля антител. Оценка ADCP, определяемая для общего количества положительных клеток CD45, обычно составляет от 25 до 35 раз выше фоновых уровней, определяемых с помощью отрицательного контроля, моноклональных антител против сибирской язвы.Каждый образец грудного молока уникален, и некоторые гранулы могут быть трудно увидеть. Кроме того, популяции лейкоцитов, и, следовательно, оценки ADCP, могут сильно варьироваться от выборки к образцу.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Выделение Брейн-Лейкоциты проникают

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Биоэнергетика и окислительного: протоколах выделения и оценки человека лейкоцитов и тромбоцитов

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Выделение экзосомы из плазмы ВИЧ-1-инфицированных

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Использование моноцитов монослоя анализе для оценки Fcγ рецептор-опосредованного Фагоцитоз

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...