Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Vi tackar Dr Susan Zolla-Pazner vid Institutionen för medicin och Institutionen för mikrobiologi vid Icahn School of Medicine på Mount Sinai för manuskriptet granskning. NIH/NICHD tillhandahöll finansiering för detta projekt under bidrags nummer R21 HD095772-01A1. Dessutom stöddes R. Powell av medel från Institutionen för medicin, avdelningen för infektionssjukdomar, Icahn School of Medicine vid berget Sinai.

Varje deltagare i denna studie rekryterades och intervjuades i enlighet med den etiska och institutionella Review Board (IRB) godkännande med vägledning och bemyndigande av Mount Sinai program för skydd av försökspersoner (PPHS) med hjälp av en IRB-godkänd protokoll för erhållande av bröst mjölks prov.
1. mål mikrosfär förberedelse
<ol><li>Välj ett relevant målantigen. Anmärkning: i detta exempel användes rekombinant protein V1V2-2F5K, ...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk.">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li><li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons.">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring:+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth.">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li><li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals.">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li><li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding:+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer's+Patches+of+the+Nursed+Infant.">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).</li><li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates.">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).</li><li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants.">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries:+a+pooled+analysis.">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies.">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li><li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1.">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).</li><li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+(ADCC)+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality.">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li><li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1.">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li><li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody Fc. , (2014).</li><li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

Flödescytometribaserad teknik för mätning av ADCP-aktivitet som beskrivs häri beskrevs först i 201130 och har sedan dess bevisats vara robust och citerad i mer än 80 studier. Det protokoll som beskrivs här anpassar denna teknik för användning med primära BM-celler för första gången. Tidigare studier av FC-medierad funktionalitet av BM-celler har i stort sett begränsats till mätning av oxidativa skurar eller histologisk-baserade fagocytos-analyser med celler isolerade från rå mjöl...

Human bröstmjölk (BM) består av moderns celler som är > 90% livskraftiga1. Cell sammansättningen påverkas starkt av skede av amning, hälsostatus av mor och spädbarn, och individuell variation, som fortfarande är dåligt förstådd1,2,3,4. Med tanke på att BM innehåller ~ 103− 105 leukocyter/ml, det kan uppskattas att ammade spädbarn mata in ~ 105− 108 maternella leukocyter dagligen5. Olika in vivo studier har visat att moderns leukocyter ger kritisk immunitet mot barnet och är funktionella långt bortom dessa platser för initial förtäring5,6,7,8 ,9,10,11. Alla materneligt framställda celler som intas av spädbarnet har potential att utföra immunförsvaret vid sidan av eller kompensera för spädbarnets egna leukocyter12.
Överföring från mor till barn (MTCT) av humant immunbristvirus (HIV) är fortfarande en kris i resursbegränsade länder. Som diarré och luftvägssjukdomar är ansvariga för betydande dödlighet bland spädbarn i resurs-begränsade länder, och dessa sjukdomar reduceras avsevärt genom exklusiv amning, fördelarna för hiv-infekterade mödrar av amning vida uppväger riskerna13,14,15. Om inte tillgång till rent vatten och lämplig modersmjölksersättning är tillförlitlig, WHO rekommenderar inte upphörande av amning för HIV-infekterade mödrar16. Ungefärligt 100 000 MTCTs via BM uppstår årligen; ändå, bara ~ 15% av spädbarn ammade av deras hiv-infekterade mödrar blir smittade, vilket tyder på en stark skyddande effekt av BM17,18,19,20,21. Många faktorer fungerar sannolikt parallellt för att förhindra överföring. Viktigt, HIV-specifika antikroppar (ABS) i BM har korrelerats med minskad MTCT och/eller reducerad spädbarnsdöd från hiv-infektion22,23. Det som fortfarande till stor del är oklart är bidraget från den cellulära fraktionen av BM till dess antivirala egenskaper.
Många ABS underlätta en mängd anti-virala aktiviteter medieras av den "konstanta" regionen av immunglobulin molekylen, den kristalliserbara fragment (FC), via interaktion med FC-receptorer (FcRs) finns på nästan alla medfödda immunceller, praktiskt taget alla som finns i human BM24. Antikroppsberoende cellulära fagocytos (ADCP) har visats som nödvändigt för clearance av virusinfektioner och har varit understuderat vid förebyggande av MTCT av hiv25,26,27, 28 , 29. med tanke på bristen på kunskap om det potentiella bidraget av ADCP verksamhet av BM fagocyter till förebyggande av MTCT av hiv, syftade vi till att utveckla en rigorös metod för att isolera celler från Human BM för att genomföra en studie av ADCP medierad av celler från BM som erhållits i olika stadier av amning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

Även i avsaknad av antiretrovirala läkemedel, endast ~ 15% av spädbarn ammade av HIV-infekterade mödrar blir smittade, vilket tyder på en stark skyddande effekt av bröstmjölk (BM). Om inte tillgång till rent vatten och lämplig modersmjölksersättning är tillförlitlig, WHO rekommenderar inte upphörande av amning för HIV-infekterade mödrar. Många faktorer som sannolikt arbetar parallellt för att minska BM överföring. Ammade spädbarn mata in ~ 105− 108 moderns leukocyter dagligen, men vad som fortfarande är till stor del oklart är bidraget från dessa celler till de antivirala kvaliteter av BM. för närvarande syftade vi till att isolera celler från Human BM för att mäta antikroppsberoende cellulära fagocytos (ADCP), en av de mest väsentliga och genomträngande medfödda immunsvar, av BM fagocyter mot HIV-mål. Cellerna isolerades från 5 humana BM-prover som erhållits i olika stadier av amning. Isolering utfördes via mild centrifugering följt av noggrann borttagning av mjölkfett och upprepad tvättning av cellpelleten. Fluorescerande pärlor belagda med HIV-kuvert (ENV) epitop användes som mål för analys av ADCP. Celler färgas med CD45 yta markör för att identifiera leukocyter. Det konstaterades att ADCP-aktiviteten var signifikant över kontroll experiment och reproducerbart mätbar med hjälp av en HIV-specifik antikropp 830A.

Mjölk kan förvaras i rumstemperatur eller svalare (men inte fryst); men med tanke på att vi har observerat minskad lönsamhet när mjölken har hållits mycket kall (data som inte visas), och att det är enklare att samla in, förvara kort och transportera i omgivningstemperaturer, rekommenderas att proverna inte kylas in för att minska prov-till-prov variation. I mjölk som erhålls 7 − 183 dagar efter partum varierade cellkoncentrationen, fastställd genom automatiserad cell räkn...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Bröstmjölk överför humant immunbristvirus (HIV), men endast ~ 15% av spädbarn ammade av HIV-infekterade mödrar blir smittade. Ammade spädbarn mata in ~ 105− 108 moderns leukocyter dagligen, även om dessa celler är understuderade. Här beskriver vi isoleringen av bröstmjölk leukocyter och en analys av deras fagocytos kapacitet.

Isolering av leukocyter från human bröstmjölk för användning i en antikroppsberoende cellulära fagocytos analys av HIV-mål

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Vi utvecklat en rigorös metod för att isolera celler från bröstmjölk för att studera antikroppsberoende cellulära fagocytos, eller AVDCP, av bröstmjölk fagocyter mot HIV-mål. Denna teknik underlättar relativt snabb och enkel isolering av bröstmjölkceller att utvärdera kapaciteten hos leukocyt populationer att utföra AVDCP. Demonstrerar proceduren blir Alisa Fox, en tekniker från mitt laboratorium.Efter att ha valt en relevant mål antigen, använd en kommersiell kit för att biotinylate proteinet av intresse enligt tillverkarens protokoll. Och deponera biotinylerat prov i den övre kammaren i en spinnkolonn. Lägg till PBS upp till 400 mikroliter och locket till kammaren innan du sätter in kolonnen i ett uppsamlingsrör för centrifugering.När du har kastat flödet genom, tillsätt PBS till 400 mikroliter för en andra centrifugering. Kassera flödet genom, tillsätt PBS till 400 mikroliter, och mäta proteinkoncentrationen med en spektrofotometer för att konjugera det biotalenylerade proteinet till mikrometermikrosfärer. Inkubera sex mikrogram protein med 12 mikroliter lagerpärlor i 200 mikroliter PBS per platta av konjugerade pärlor vid rumstemperatur i två timmar, med skonsam virvelning var 20:e minut.I slutet av inkubationen pelleterar proteinet konjugerade pärlor genom centrifugering och kasserar supernatanten. Efter mild virvelning, resuspend proteinet i 1200 mikroliter av 0,1%BSA i PBS, och tvätta röret genom centrifugeringen ytterligare två gånger som bara visat. Efter den sista tvätten, resuspend pelleten i 1200 mikroliter i PBS plus BSA.För att ställa in ADCP Assay Plates, först förbereda 12 mikroliter utspädningar av antikropp, eller immun serum av intresse, i 2%BSA i PBS i en rund botten 96 väl platta. Tillsätt 10 mikroliter proteinkonjugerade pärlor per brunn till plattan för en två timmars inkubation vid 37 grader Celsius. I slutet av inkubationen, tillsätt 200 mikroliter pbs plus BSA.Efter att ha erhållit bröstmjölk från friska lakterande kvinnor som uttrycker med hjälp av en pump, inom fyra timmar efter uttryck separera mjölkinnehållet genom centrifugeringen och häll försiktigt bort skummjölk och fett, lämnar cellen pelleten ostörd. Torka av insidan av röret med en luddfri torka för att ta bort allt fett från rörväggen och tillsätt 10 milliliter PBS plus HSA. Resuspend pelleten med mild pipettering för att undvika cellaktivering i apoptosen, och överför cellupphängningen till ett 15 milliliterrör för centrifugeringen.Efter en andra tvätt i PBS plus HSA som just visat, försiktigt återanvända cellerna i en till två milliliter av färska PBS plus HSA för räkning. För en ADCP-analys, snabbt invertera den beredda ADCP plattan att dekantera supernatanten efter den slutliga centrifugeringen och tillsätt fem gånger 10 vid en fjärde nyligen isolerade bröstmjölkceller i 200 mikroliter pbs plus BSA för en två timmars inkubation vid 37 grader Celsius. I slutet av inkubationen centrifugera cellerna och tvätta pellets två gånger i 200 mikroliter av färska PBS som visats.Efter den sista tvätten, färga cellerna med 0,5 mikrogram per milliliter av fixerbar livsduglighet fläck 450 per brunn i 50 mikroliter PBS i 30 minuter vid rumstemperatur, skyddas från ljus. I slutet av inkubationen, pellet cellerna för två tvättar i färska PBS som visas, och färga cellerna för leukocyt markörer av intresse för 30 minuter vid rumstemperatur, skyddas från ljus. I slutet av inkubationen, samla cellerna centrifugation, och tvätta cellerna två gånger i 200 mikroliter av 1%BSA plus PBS per tvätt.Efter den sista tvätten, fixera pellets i 200 mikroliter på 0,5%formaldehyd per brunn i 30 minuter vid rumstemperatur, skyddad från ljus. För flödescytometrisk analys av cellproverna, ställ in en flödescytometer utrustad med en höggenomströmningsplattasläsare för att dra tillbaka 175 mikroliterprov och för att samla in 5000 celler per brunn. Utför den inledande gating att eliminera dubbler och skräp på en framåt scatter kontra sida scatter tomt.Använd en sida scatter kontra livskraft fläcken tomt att eliminera de döda cellerna. Och använda en sida scatter kontra CD45 tomt för att skilja de stora leukocyte klasser. För alla CD45 positiva celler, eller för varje leukocyt delmängd av intresse, mäta antikroppsberoende cellulära fagocytos verksamhet genom att gating med en markör på pärlan positiva celler i ett histogram av lämplig fluorophore kanal för de konjugerade pärlor.Beräkna sedan antikroppsberoende cellulära fagocytospoäng som median för fluorescensintensiteten hos pärlans positiva celler med procentandelen av den totala CD45 plus cellerna i den positiva populationen. Här visas den gating strategin för att eliminera dubbler, skräp och döda celler. Mellan en till 12%av totala levande celler är typiskt CD45 positiva leukocyter med de flesta av de påstådda sidan scatter låg till mellanliggande CD45 låg monocyter verkar vara prekursorer, eller att omogna celler, baserat på sidan scatter kontra CD45 gating.De påstådda granulocyterna definieras som sidan scatter hög, CD45 mellanliggande celler. Mätning av ADCP-aktiviteten hos nyligen isolerade bröstmjölkceller med användning av en hiv-specifik monoklonal antikropp hos människa vid en månads postpartum avslöjar att behandling med aktinhämmaren Cytochalasin D och eller Fc-receptorblockerande antikroppar före inkubation med antikroppsbundna antigen kopplade pärlor resulterar i AVDCP-aktiviteten vid eller under den som observerats i närvaro av kontrollantikropp. ADCP-poängen som bestämts för totala CD45 positiva celler är vanligen mellan 25 till 35 gånger över bakgrundsnivåerna, definieras med hjälp av en negativ kontroll, anti-mjältbrand monoklonal antikropp.Varje bröstmjölk prov är unik och vissa pellets kan vara svårt att se. Dessutom kan leukocytpopulationerna, och därmed ADCP-poängen, variera oerhört från prov till prov.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolering av Brain-infiltrera leukocyter

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik och Oxidativ Burst: Protokoll för isolering och utvärdering av humana leukocyter och trombocyter

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocyter från Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyter från Murina vävnader på Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolering av exosomes från plasma HIV-1 positiva individer

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering av infiltrerande leukocyter från mus Skin Använda Enzymatisk Digest och Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Användning av en monocyt Monolayer analys för att utvärdera Fcy-receptor-medierad fagocytos

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...