Name: isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi Tıp Bölümü ve Mikrobiyoloji Bölümü'nden Dr. Susan Zolla-Pazner'a makale incelemesi için teşekkür ederiz. NIH/NICHD bu proje için R21 HD095772-01A1 hibe numarası altında fon sağladı. Buna ek olarak, R. Powell Tıp Bölümü, Bulaşıcı Hastalıklar Bölümü, Mount Sinai Icahn Tıp Okulu fonları tarafından desteklendi.

Bu çalışmadaki her katılımcı, IRB onaylı bir IRB onaylı kullanılarak Mount Sinai'nin İnsan Deneklerini Koruma Programı'nın (PPHS) rehberliği ve onayı ile etik ve kurumsal inceleme kurulu (IRB) onayı ile işe alındı ve mülakata alındı. anne sütü örnekleri almak için protokol.
1. Hedef Mikrosfer hazırlığı
<ol><li>İlgili bir hedef antijeni seçin. NOT: Bu örnekte, rekombinant protein V1V2-2F5K kullanılmıştır, hangi yerli HI...

<ol>
	<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+milk:+state+of+the+science.">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li><li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins.">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li><li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance.">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li><li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+(7-20+months).">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding.">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li><li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system.">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li><li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk.">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li><li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons.">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring:+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth.">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li><li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals.">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li><li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding:+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer's+Patches+of+the+Nursed+Infant.">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).</li><li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates.">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).</li><li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women.">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li><li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants.">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries:+a+pooled+analysis.">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding:+The+Duration+of+Breastfeeding,+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee.">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk.">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li><li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission:+past+successes,+current+progress+and+challenges,+and+future+directions.">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li><li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women.">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).</li><li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies.">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li><li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1.">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).</li><li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+(ADCC)+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality.">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li><li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1.">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li><li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody Fc. , (2014).</li><li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections.">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li><li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice.">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li><li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells.">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li><li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus.">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li><li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease.">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li><li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples.">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits.">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li><li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+next-generation+cleaved,+soluble+HIV-1+Env+trimer,+BG505+SOSIP.664+gp140,+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies.">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).</li><li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets.">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li><li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry.">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).</li><li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum:+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure.">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li><li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant.">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li></ol>

Burada tanımlanan ADCP aktivitesini ölçmek için akış sitometrisi bazlı teknik ilk olarak 201130 yılında tanımlanmış ve o zamandan beri sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve 80'den fazla çalışmada belirtilmiştir. Burada açıklanan protokol, bu tekniği ilk kez birincil BM hücreleriyle kullanılmak üzere uyarlar. BM hücreleri tarafından Fc aracılı işlevsellik önceki çalışmalar büyük ölçüde oksidatif patlamalar veya histoloji tabanlı fagositoz testleri kolostrum izol...

İnsan anne sütü (BM) anne hücrelerinden oluşur >90% canlı1. Hücre bileşimi güçlü emzirme aşamasında etkilenir, anne ve bebeğin sağlık durumu, ve bireysel varyasyon, hangi kötü anlaşılmış kalır1,2,3,4. BM~103−105 lökosit/mL içerdiği göz önüne alındığında, anne sütüyle beslenen bebeklerin günlük5~105−108 maternal lökosit yuttukları tahmin edilebilir. Çeşitli in vivo çalışmalar, maternal lökositlerin bebeğe kritik bağışıklık sağladığını ve bu ilk yutma alanlarının çok ötesinde fonksiyonel olduğunu göstermiştir5,6,7,8 ,9,10,11. Bebek tarafından yutulan tüm anne kaynaklı hücreler yanında bağışıklık fonksiyonları gerçekleştirmek veya bebeğin kendi lökositler telafi etmek için potansiyele sahip12.
İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) anne-çocuk iletimi (MTCT) kaynak sınırlı ülkelerde bir kriz olmaya devam etmektedir. İshal ve solunum yolu hastalıkları kaynak sınırlı ülkelerde bebekler arasında mortalite önemli oranlarda sorumlu olduğundan ve bu hastalıklar önemli ölçüde özel emzirme ile azalır, HIV enfekte anneler için faydaları emzirme çok riskleri ağır basar13,14,15. Temiz su ve uygun bebek formülü erişim güvenilir olmadığı sürece, WHO HIV enfekte anneler için emzirme kesilmesini önermez16. BM üzerinden yılda yaklaşık 100.000 MTCT meydana gelir; henüz, hiv-enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~ 15% enfekte olur, BM güçlü bir koruyucu etkisi düşündüren17,18,19,20,21. Çok sayıda faktör büyük olasılıkla iletimi önlemek için birlikte çalışır. Daha da önemlisi, BM'de HIV spesifik antikorlar (Abs) azaltılmış MTCT ve / veya HIV enfeksiyonu22,23azaltılmış bebek ölümü ile ilişkili olmuştur. Bm'nin hücresel fraksiyonunun antiviral niteliklerine katkısı büyük ölçüde belirsizdir.
Birçok Abs immünglobulin molekülünün 'sabit' bölgesi tarafından aracılık anti-viral faaliyetleri çeşitli kolaylaştırmak, kristalize parça (Fc), Fc reseptörleri ile etkileşim yoluyla (FcR) hemen hemen tüm doğuştan gelen bağışıklık hücreleri üzerinde bulunan, hemen hemen hepsi insan BM24bulunur. Antikorbağımlı hücresel fagositoz (ADCP) viral enfeksiyonların temizlenmesi için gerekli olarak gösterilmiştir ve HIV MTCT önlenmesi durumunda understudied olmuştur25,26,27, 28.000 , 29. BM fagositleri tarafından ADCP aktivitesinin HIV MTCT'sinin önlenmesine olası katkısı hakkında bilginin azlığı göz önüne alındığında, hücreleri insan BM'den izole etmek için sıkı bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. BM emzirmenin çeşitli aşamalarında elde edilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:725px;" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">1 &#181;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">F8776</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td style="width:85px;">560975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">8810025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning V-bottom polystyrene 96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin D</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:85px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable Viability Stain 450&#160;</td>
			<td style="width:193px;">BD</td>
			<td>562247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:193px;">Sigma</td>
			<td>252549&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red</td>
			<td style="width:193px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:85px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:85px;">564219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin</td>
			<td style="width:193px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:85px;">2191349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">PBS 1x pH 7.4</td>
			<td style="width:193px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:85px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:356px;">Polystyrene 10mL Serological Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:193px;">Corning&#160;</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:193px;">Pierce</td>
			<td style="width:85px;">88512</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from human breast milk for use in an antibody-dependent cellular phagocytosis assay of hiv targets

Antiretroviral ilaçların yokluğunda bile, HIV ile enfekte olmuş anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~% 15 enfekte olur, anne sütü güçlü bir koruyucu etkisi düşündüren (BM). Temiz suya erişim ve uygun bebek formülü güvenilir olmadığı sürece, WHO HIV bulaşmış anneler için emzirmenin durdurulmasını önermez. Bm iletimini azaltmak için çok sayıda faktör büyük olasılıkla birlikte çalışır. Anne sütüyle beslenen bebekler günlük ~105−108 maternal lökosit yutmaktadır, ancak bu hücrelerin BM'nin antiviral niteliklerine katkısı büyük ölçüde belirsizdir. HIV hedeflerine karşı BM fagositleri tarafından en önemli ve yaygın doğuştan gelen immün yanıtlardan biri olan antikorbağımlı hücresel fagositoz (ADCP). Hücreler emzirmenin çeşitli aşamalarında elde edilen 5 insan BM örneğinden izole edildi. İzolasyon, süt yağının dikkatli bir şekilde çıkarılması ve hücre peletinin tekrartekrar yıkanması ile nazik santrifüj yoluyla gerçekleştirildi. HIV zarfı (Env) epitop ile kaplanmış floresan boncuklar ADCP analizinde hedef olarak kullanılmıştır. Hücreler lökositleri tanımlamak için CD45 yüzey belirteci ile boyandı. BU ADCP aktivitesi kontrol deneyleri yukarıda önemli ve tekrarlanabilir bir HIV özgü antikor 830A kullanarak bulundu.

Süt oda sıcaklığında veya soğutucuda saklanabilir (dondurulmuş olmasa da); ancak, sütün çok soğuk tutulduğunda (veriler gösterilmediğinde) daha az canlılık gözlemlediğimiz ve ortam sıcaklıklarında toplanması, depolanmasını ve taşınmasının daha kolay olduğu göz önüne alındığında, numunelerin soğutulmaması tavsiye edilir. örnek-numune değişkenliği. 7−183 gün sonra elde edilen sütte, otomatik hücre sayacı tarafından belirlenen hücre konsantra...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Anne sütü insan immün yetmezlik virüsü (HIV) iletir, ancak HIV enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~% 15 enfekte olur. Anne sütüyle beslenen bebekler günlük ~105−108 maternal lökosit yutmaktadır, ancak bu hücreler incelenmiştir. Burada anne sütü lökositlerinin izolasyonu ve fagositik kapasitelerinin analizini anlatıyoruz.

Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Hiv hedeflerine karşı anne sütü fagositleri ile antikorbağımlı hücresel fagositis veya ADCP'yi incelemek için insan sütünden hücreleri izole etmek için titiz bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, lökosit popülasyonlarının ADCP yapma kapasitesini değerlendirmek için anne sütü hücrelerinin nispeten hızlı ve kolay izolasyonuna yardımcı olur. Prosedürü gösteren Alisa Fox, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.İlgili bir hedef antijen seçtikten sonra, üreticinin protokolüne göre ilgi proteinbiyotinylate ticari bir kit kullanın. Ve biyotinylated örneği bir spin sütununun üst odasına yatırın. 400 mikrolitreye kadar PBS ekleyin ve kolonsantrifüj için bir toplama tüpü içine eklemeden önce haznekapağı.Akışı attıktan sonra, ikinci bir santrifüj için 400 mikrolitreye PBS ekleyin. Akışı atın, 400 mikrolitreye PBS ekleyin ve biyotinylated proteini mikrosferlere ayırmak için bir spektrofotometre ile protein konsantrasyonu ölçün. Oda sıcaklığında iki saat boyunca konjuge boncuk tabağı başına 200 mikrolitre PBS'de 12 mikrolitre stok boncuk la birlikte altı mikrogram protein inkübün.Kuluçka sonunda, santrifüj ile protein konjuge boncuk pelet ve supernatant atın. Nazik girdap sonra, PBS 0.1% BSA 1200 mikrolitre protein resuspend, ve santrifüj ile tüp yıkayın iki kez daha az gösterdiği gibi. Son yıkamadan sonra, PBS artı BSA 1200 mikrolitre pelet resuspend.ADCP Tahsna Levhaları kurmak için, ilk yuvarlak bir alt 96 iyi plaka PBS% 2 BSA antikor veya ilgi bağışıklık serum12 mikrolitre seyreltme hazırlamak. 37 santigrat derecede iki saatlik kuluçka için plakaya iyi başına protein konjuge boncuk 10 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, PBS artı BSA 200 mikrolitre ekleyin.Sağlıklı emziren kadınlardan insan sütü aldıktan sonra pompa kullanarak ifade, ifade dört saat içinde santrifüj ile süt içeriğini ayırmak ve dikkatle yağsız süt ve yağ dökün, hücre pelet rahatsız bırakarak. Tüpün içini tüy bırakmayan bir mendille silin ve tüm yağları tüp duvarından çıkarın ve 10 mililitre PBS artı HSA ekleyin. Apoptozda hücre aktivasyonunu önlemek için peleti nazik pipetleme ile yeniden askıya alın ve santrifüj için hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.PBS artı HSA'da ikinci bir yıkamadan sonra, bir ila iki mililitre taze PBS artı HSA'daki hücreleri saymak için yavaşça yeniden askıya alın. Bir ADCP Tahlil için, hızlı bir şekilde son santrifüj sonra supernatant decant hazırlanan ADCP plaka ters ve pbs artı BSA 200 mikrolitre dördüncü taze izole anne sütü hücrelerinde beş kez 10 eklemek 37 santigrat derece iki saatlik kuluçka için. Kuluçka sonunda, hücreleri santrifüj ve taze PBS 200 mikrolitre iki kez pelet yıkama.Son yıkamadan sonra, hücreleri mililitre başına 0,5 mikrogram sabitlenebilir canlılık lekesi ile lekeleyin 50 mikrolitre PBS'de 50 mikrolitre de ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca. Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi taze PBS iki yıkama hücreleri pelet, ve oda sıcaklığında ilgi lökosit belirteçleri için hücreleri leke, ışıktan korunan. Kuluçka sonunda, hücreleri santrifüj toplamak ve yıkama başına% 1 BSA artı PBS 200 mikrolitre iki kez hücreleri yıkayın.Son yıkamadan sonra, peletleri 200 mikrolitrede, her kuyu başına %0,5 formaldehit halinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, ışıktan korunan şekilde düzeltin. Hücre örneklerinin akış sitometrik analizi için, 175 mikrolitre numune çekmek ve kuyu başına 5000 hücre toplamak için yüksek iş leme plaka okuyucusuyla donatılmış bir akış sitometreayarlayın. İleri dağılım ayarı ve yan dağılım çiziminde çift ekibe ve enkazı ortadan kaldırmak için ilk gating'i gerçekleştirin.Ölü hücreleri ortadan kaldırmak için canlılık leke arsa karşı bir yan dağılım kullanın. Ve büyük lökosit sınıfları ayırt etmek için CD45 arsa karşı bir yan dağılım kullanın. Tüm CD45 pozitif hücreler için, ya da ilgi her lökosit alt kümesi için, konjuge boncuklar için uygun florofor kanalının bir histogramboncuk pozitif hücrelerin üzerinde bir belirteç ile gating tarafından antikor bağımlı hücresel fagositoz aktivitesini ölçmek.Daha sonra toplam CD45 artı pozitif popülasyondaki hücrelerin yüzdesi ile boncuk pozitif hücrelerin floresan yoğunluğunun ortanca olarak antikor bağımlı hücresel fagositoz puanları hesaplamak. Burada, doublets, enkaz ve ölü hücreleri ortadan kaldırmak için gating stratejisi gösterilir. Toplam canlı hücrelerin %1 ila %12'si tipik olarak CD45 pozitif lökositlerdir ve sözde yan dağılımların çoğu düşük ila orta CD45 düşük monositler öncül olarak görünen veya cd45 gating'e karşı yan dağılıma dayalı olgunlaşmamış hücrelerdir.Sözde granülositler yan dağılım yüksek, CD45 ara hücreler olarak tanımlanır. Bir ay postpartumda HIV spesifik insan monoklonal antikor kullanarak yeni izole anne sütü hücrelerinin ADCP aktivitesinin ölçümü, antibody bağlı antijen ile kuluçka dan önce aktin inhibitörü Sitokasin D ve fc reseptör bloke antikorları ile tedavi nin kontrol antikor varlığında gözlenen ADCP aktivitesi veya altında ADCP aktivitesi ile sonuçlandığını ortaya koymaktadır. Toplam CD45 pozitif hücreler için belirlenen ADCP skoru genellikle arka plan düzeylerinin 25 ila 35 kat üzerindedir, negatif kontrol, anti-şarbon monoklonal antikor kullanılarak tanımlanır.Her anne sütü örneği benzersizdir ve bazı peletleri görmek zor olabilir. Buna ek olarak, lökosit popülasyonları ve bu nedenle ADCP skorları örnekten örneğe son derece farklılık gösterebilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...