Name: generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Vi vil gerne takke Katherine Roberts for hendes pleje af axolotl kolonien. Finansieringen af dette arbejde blev ydet af Connecticut Innovations Regenerativ Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 og 15-RMB-YALE-01) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individuelle Postdoctoral Fællesskab F32HD086942).

Eksperimentelle procedurer, der anvendes i denne protokol, blev godkendt af Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017-10557) og var i overensstemmelse med alle føderale politikker og retningslinjer for anvendelse af hvirveldyr. Alle dyreforsøg blev udført på Ambystoma mexicanum (axolotls) i faciliteter på Yale University.
1. Generering af diploid embryo
<ol><li>Anskaffe GFP + diploid embryoner til at tjene som graft værter gennem naturlig parring...

<ol>
	<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum.">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li><li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs.">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li><li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li><li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate:+the+axolotl.">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li><li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Axolotl+Heads.">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs.">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li><li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields.">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li><li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program.">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352 (2013).</li><li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration.">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I:+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression.">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+(32+Gb)+Axolotl+Genome.">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548 (2018).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li><li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development.">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li><li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl.">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li><li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl.">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li><li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration.">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System.">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Meets+Single:+The+Application+of.">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li><li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs.">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li><li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li><li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+stages+of+development+of+the+axolotl,+Ambystoma+mexicanum.">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li><li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen.">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li><li>Fei, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li></ol>

Der er et par kritiske trin i vores protokol til generering haploid-diploid kimærer, at driftsteknikeren bør overveje for konsekvent podning resultater.
Den mest sandsynlige årsag til haploid generation til at mislykkes skyldes dårlig in vitro aktivering betingelser. De korrekte mængder motilesæd skal anvendes til at aktivere æg. For at forlænge motiliteten bør sædprøver altid opbevares ved 4 °C. Før du anvender en sædprøve på æg, skal du kontrollere sædcellernes levedygtighe...

Historisk set har embryonale vævspodning i padder været en vigtig teknik til at udforske grundlæggende mekanismer for udviklingsbiologi og regenerering. Den axolotl, en art af salamander, besidder en imponerende evne til at regenerere væv og komplekse strukturer såsom lemmer og organer efter skade eller amputation. Tilsvarende imponerende, de kan modtage, uden afvisning, vævgrafts fra andre personer på embryonale, unge, og voksne stadier1,2,3. Regioner af embryoner, der producerer hele strukturer såsom lemmer, haler, øjne og hoveder, og mere specifikke væv, såsom neuroektoderm og somiter, kan podes mellem embryoner til at producere kimære dyr1,2,4,5,6. I næsten et århundrede har undersøgelser af sådanne kimære dyr givet afgørende indsigt i regenerering, vævsdifferentiering, størrelseskontrol ogmønstre1,7,8.
I det sidste årti har talrige transskriptionelle undersøgelser af regenererende væv givet indsigt i de genetiske programmer, der ligger til grund for salamanderregenerering9,10,11,12,13. Disse undersøgelser har føjet til en voksende liste over kandidat gener, der til dato er stort set ukarakteriseret i forbindelse med regenerering. Målrettede mutagenese teknikker, såsom CRISPR / Cas, nu tillader undersøgelse af sådanne gener, og sådanne genetiske tilgange er stærkt lettet af den seneste sekventering og samling af den store axolotl genom14,15,16.
Vi forsøgte at udvikle teknikker, der koblede klassisk udviklingsbiologi sammen med ny genetisk teknologi med henblik på at dissekere regenereringsmekanismerne. Der er i årtier17etableret metoder til fremstilling af haploidembryoner af axolotls og andre salamandere . Mens disse teknikker længe har været bemærket at være fordele ved salamandere som genetiske model organismer18, få efterfølgende genetiske undersøgelser har indarbejdet haploid dyr. Vi bruger in vitro aktivering i axolotl til at producere haploid embryoner, der tjener som væv donorer til podning19. Ved hjælp af embryoner med fluorescerende genetiske markører har vi udviklet pålidelige metoder til at generere lemmer, der næsten udelukkende stammer fra donorvæv (figur 1A). Ved at kombinere disse to teknikker har vi omgået den sene embryonale dødelighed, der er forbundet med haploidy, hvilket giver mulighed for produktion af fuldt udviklede, podede haploidlemmer(figur 1B, figur 1B«og figur 2).
Ved at gennemføre CRISPR/Cas-medieret mutagenesis i haploid embryoner før podning for at skabe kimære axolotls med mutant haploid lemmer, kan vi undersøge genfunktion specifikt i forbindelse med lemmer udvikling og regenerering. Dette gør det muligt at redde lemmer fra potentielt embryonale-dødelige mutant fænotyper. Mens CRISPR / Cas mikroinjektion kan generere dyr, der er meget mutant, sådanne dyr er typisk meget mosaik, med en vis grad af fastholdelse af vilde arter alleler og en række forskellige mutationer på målrettede steder14,20. CRISPR-baserede mutagenese i haploidceller øger penetrance af enkelt allel tab af funktion mutationer, da de ikke kan maskeres af bevarede vilde type alleler. Derfor anvendes CRISPR-baseret screening i haploidcellelinjer i stigende grad til at undersøge det genetiske grundlag for mange cellulære processer21,22,23. Ved at kombinere CRISPR-baserede afstamning sporing med vores haploid lemmer knop podning protokoller, den tilgang, der er beskrevet her kan tjene som en platform for haploid genetiske skærme i levende dyr20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-1</td>
			<td>Only use Dumostar material (can be autoclaved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400 (polysucrose 400)</td>
			<td>bioworld</td>
			<td>40600032-3</td>
			<td>Ficoll 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1914-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating/Cooling Incubator</td>
			<td>RevSci</td>
			<td>RS-IF-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td>Chorulon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>40 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miroscope Cooling Stage</td>
			<td>Brook Industries</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLS Cas9 Protein</td>
			<td>PNAbio</td>
			<td>CP01-200</td>
			<td>4 vials of 50 &#181;g protein each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Treatment level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0x Marc&#39;s modified Ringer&#39;s solution (MMR)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Holtfreter&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of chimeric axolotls with mutant haploid limbs through embryonic grafting

Et voksende sæt af genetiske teknikker og ressourcer gør det muligt for forskere at sonde den molekylære oprindelse af evnen af nogle arter af salamandere, såsom axolotls, at regenerere hele lemmer som voksne. Her skitserer vi teknikker, der anvendes til at generere kimære axolotls med Cas9-muttagenized haploid forlemmer, der kan bruges til at udforske genfunktion og troskab lemmer regenerering. Vi kombinerer flere embryologiske og genetiske teknikker, herunder haploid generation via in vitro aktivering, CRISPR/Cas9 mutagenese, og væv podning i en protokol til at producere et unikt system til haploid genetisk screening i en model organisme af regenerering. Denne strategi reducerer antallet af dyr, rum og tid, der kræves til funktionel analyse af gener i lemmer regenerering. Dette gør det også muligt at undersøge regenereringsspecifikke funktioner af gener, der kan være nødvendige for andre væsentlige processer, såsom organogenese, vævmorfosese, og andre væsentlige embryonale processer. Den metode, der er beskrevet her, er en unik platform til at gennemføre haploid genetisk screening i et hvirveldyr modelsystem.

Udvikling af haploid embryoner kan skelnes fra diploid embryoner ved deres 'haploid syndrom' fænotype29. På graft-stage udviser haploidembryoner reduceret krumning langs den bageste efteranterakse og ufuldstændige indhegning af blommeproppen (figur 3A). Et fluorescerende mikroskop kan anvendes til at sikre, at haploidembryoner er fri for faderligt afledt GFP-udtryk (figur 3B</st...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting at JoVE.com

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Dette mål med denne protokol er at producere kimære axolotls med haploid forelimbs stammer fra Cas9-muttageniseret donorvæv ved hjælp af embryonale væv podning teknikker.

Generation af chimeric Axolotls med Mutant Haploid Lemmer gennem embryonale podning

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Denne protokol tillader produktion af mutageniserede haploide lemmer, der kan bruges til genetisk screening i axolotl. I haploider kan selv lav-mutagenesis producere tab af funktion fænotyper i cellerne. Denne podning teknik kan også bruges til at redde embryonale dødelige fænotyper.Denne metode kan bruges til at studere regenerering i enhver padde arter, der er modtagelige for in vitro befrugtning og podning. Før haploide embryoner som donorer, anbefaler vi at praktisere og bekræfte grafts succes mellem GFP positive og negative diploid embryoner. For kvindelige gamete donor forberedelse, bedøve en seksuelt moden hvid eller hvid RFP kvindelige axolotl til at tjene som gamete donor.Efter at have bekræftet en manglende reaktion på smerte simulering, bruge en 30 gauge insulin sprøjte til at injicere 0,15 milliliter af humane chorioniske gonadotropin i muskulaturen dorsale til bagekstremiteten. Sæt sprøjten i en vinkel på 45 grader i forhold til midterlinjen for at undgå kontakt med rygmarven. Placer det injicerede dyr i frisk 40% Holtfreter opløsning og overføre axolotl til en otte til 12 grader Celsius køleskab i 48 timer.Vend derefter hunnen tilbage til stuetemperatur. Mens hunnen lægger æg, skal du placere en fuldt bedøvet hann i liggende position på fugtige papirhåndklæder under et dissekerende mikroskop og placere spidsen af en P1000 pipette i bunden af cloaca med den dominerende hånd. Placer den anden pegefinger og tommelfinger to til tre centimeter rostral til bækkenet og forsigtigt klemme dyret, mens du flytter fingrene mod bagbenene for at skylle de spermiske urinprøver indsamle hver prøve i en ny mikrocentrifuge rør.Overfør derefter fem mikroliter fra hver prøve til en petriskål for at inspicere sædkvaliteten ved hjælp af et omvendt mikroskop. Efter optælling fortyndes sæden til en koncentration på otte gange 10 til de fjerde celler pr. milliliter i 0,1 X steril MMR og overføres 0,5 mikroliter sædceller pr. æg til en ny petriskål. Brug derefter pipettespidsen til at sprede suspensionen til et 1 millimeter tykt lag og brug en plastikløfte til at placere prøven fire centimeter fra pærerne på en 254 nanometer crosslinker til bestråling ved otte gange 10 til det femte mikroben pr. millimeter kvadreret.Efter indsamling af en sund sædprøve, placere hunnen i liggende position på en stak fugtige papirhåndklæder og bruge en lignende rødmen bevægelse til at udtrække ubefrugtede æg fra den kvindelige axolotl. Brug derefter våde kraftafkast til at overføre æggene til en 10 centimeter petriskål. Inden for 15 minutter efter indsamling, bruge en P10 pipette til at dispensere den bestrålede sæd på de ubefrugtede æg belægning hvert æg med 0,25 til 0,5 mikroliter af inaktiverede sædceller.Efter at have ladet æggene sidde ved stuetemperatur i 30 minutter, oversvømme æggene med 0,1 X MMR. Tredive minutter efter hydrering, bruge skarpe kraftbefængte til at dejelly æggene og placere æggene på 18 grader Celsius for mikroinjektion inden for syv timer. For at generere en haploid-diploid kimær, placere en sund haploid donor med en eller to trin matchede GFP positive diploid vært embryoner inde i lavpunktet af en pre-kølet driftsskål indeholder kirurgisk medium på en 10 grader Celsius eller lavere køletrin.Brug to ultra fine autoclaved lige spids kraftvipper til at fjerne hele lemmer opløbet og de omkringliggende ectoderm og mesoderm væv lag og der er afsat værten væv. En vævshæk i samme størrelse fjernes fra haploiddonoren, og haploiddonorvævskeden på værtsembryonens tilsvarende område. Fastgør vævet med et autoklaveret rektangulært glasskår fra et knust mikroskopdækglas, og tryk forsigtigt vævet ind i værtsembrynet.Lad ankeret være på plads i 60 til 75 minutter, der kontrollerer hvert 20. Overfør de indgraferede embryoner til frisk kirurgisk medium giver dem mulighed for at helbrede ved otte til 12 grader Celsius natten før boliger de engrafted embryoner individuelt i 12 eller 24-brønd plader. 38,7 % af oocytterne udviklede sig til normalt udviklede haploide embryoner.På graftstadiet udviser haploide embryoner en reduceret krumning langs den forreste bageste akse og et ufuldstændigt kabinet af æggeblommeproppen. Derudover kan et fluorescerende mikroskop bruges til at bekræfte, at haploide embryoner er fri for paternal-afledt GFP-udtryk. Mislykkedes og uren grafts producere en række fænotyper.Når grafts er rene og normalt udvikles, GFP udtryk bør begrænses primært til brachiale plexus, det neurale netværk stammer fra værten rygmarven. PunktformigT GFP-udtryk er også til stede i enkelte celler, der synes at være sensoriske neuroner i blodbaserede værtsceller, der migrerer ind i det udviklende legemsdel. Når RFP positive donorer anvendes, haploid graft lemmer udviser et universelt udtryk for RFP.Under hele udviklingen, ikke-mutageniserede haploid lemmer er betydeligt kortere end de modsatrettede diploid forelimbs i kimære dyr. Ikke-mutageniserede haploide lemmer regenererer fuldt ud, selv om de viser en lille forsinkelse i at nå den digitale udvækstfase sammenlignet med diploids. Husk at bruge steril teknik og helt fjerne og erstatte den fulde mesoderm og ectoderm væv lag fra embryonale vært for at producere en rent podet lemmer.Mutant lemmer kan amputeres og scorede for regenerering fænotyper. Mutant alleler kan kvantificeres med næste generation sekventering. Kombineret med CRISPR-Cas9 mutagenese har vores podningsteknik givet os mulighed for at gennemføre en negativ udvælgelsesskærm af målrettede gener i regenerering af haploide lemmer.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Den Terroir Concept Fortolket gennem Grape Berry Metabolomics og Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Dannelse af fluorescerende protein-fusioner i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar Ion Channel Expression gennem Inducible Transient transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation af indfødte kromatin Immunoprecipitation sekventering biblioteker for Nucleosome tæthed analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokol for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation af en gen-forstyrret Streptococcus mutans stamme uden Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generation af tumor Organoider fra genetisk manipulerede musemodeller af prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generation af definerede genomiske modifikationer med CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Brug af næste generations sekventering til at identificere mutationer forbundet med reparation af et CAS9-induceret dobbeltstrengsbrud nær CD4-promotoren

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...